蛋白质组学基础 ：常见蛋白酶的结构、来源及性质
2025-03-19 来源:本站 点击次数:405
蛋白酶解是自下而上蛋白质组学实验中的重要步骤。通常，长度在7-35个氨基酸之间的多肽更加适合用于质谱采集。过长的肽段很难采集到较好的质谱谱图，甚至可能在样品制备过程中就与固相萃取吸附剂结合而丢失。过短的肽段由于与数据库中所有蛋白的随机匹配度较高产生较大的假阳性，意义也不大。因此，需要根据样本特点和研究需求，选择合适的蛋白酶进行酶切，必要时，可结合几种不同的酶使用。
蛋白质组实验中常见的一些蛋白酶见表1，此部分内容参考Jesse G. Meyer等[1]的最新综述整理。酶的选择主要取决于应用场景。一般来说，对于简单的蛋白质组定性定量，通常仅使用trypsin即可。然而，对于未知序列的蛋白，则必须借助多酶联合酶切的方式，通过从头测序技术完成蛋白序列的组装[2-6]。
(表格参考)
Trypsin
胰蛋白酶（trypsin），特异性强、效率高、成本低、适用性广，是蛋白质组学实验中最常用的酶[7]。胰蛋白酶通常在碱性氨基酸Arg和Lys的C末端切割，但如果后面紧邻脯氨酸（R/KP）则一般不切。胰蛋白酶产生的多肽长度、疏水性均非常适合色谱分离、MS的碎裂和采集，谱图易于进行序列鉴定。尽管如此，理论上胰酶也只能覆盖从基因组预测的蛋白质组的一小部分。对于R和K密集切相邻较近的蛋白，会产生大量短肽，而在缺乏R/K的蛋白质区域中，会产生过长的肽段。
α-lytic
基于酵母蛋白质组的水解多肽分布发现，α-裂解蛋白酶（ALP）的野生型（WALP）对丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸等较小的脂肪族氨基酸具有显著特异性，此外对苏氨酸和丝氨酸也有一定的特异性。突变型（MALP）对蛋氨酸、苯丙氨酸等稍大的氨基酸具有特异性，值得注意的是，相较于异亮氨酸，对亮氨酸更有偏向性。
Glu-C
Glu-C（也称V8）蛋白酶，是一种从金黄色葡萄球菌223获得的丝氨酸蛋白酶，在谷氨酸和天冬氨酸的C端切割。
Asp-N
Asp-N催化天冬氨酸残基N端肽键的水解。该酶的最佳反应pH值介于4-9之间。由于它属于金属蛋白酶，使用Asp-N时应避免使用螯合剂（如EDTA）作为缓冲液。研究还表明，当蛋白水解缓冲液中存在表面活性剂时，Asp-N会在谷氨酸的氨基末端切割[8]。Asp-N 的漏切比较多[9]。
Chymotrypsin
Chymoreypsin在疏水性氨基酸 Phe、Trp、Tyr和Met和Leu 残基的C端进行切割。由于膜蛋白的跨膜区通常缺乏trypsin切割位点，因此该酶可与具有更多疏水性残基的膜蛋白配合试用[9-11]。
Arg-C
Arg-C是主要水解C端Arg残基，少量水解Lys残基，产生的肽通常比trypsin更长。Arg-C经常与其他蛋白酶一起使用，以改进定性蛋白质组数据并用于研究翻译后修饰[12]。
Ulilysin
Ulilysin（即LysargiNase）可以视作trypsin的镜像酶，可特异性地切割Lys和Arg残基的N端。因此，它能够发现使用trypsin无法观察到的C端多肽。此外，它还可以切割修饰氨基酸，例如甲基化或二甲基化的Arg和Lys[13]。
Lys-N
Lys-N切割Lys的N端，在pH=9.0时活性最高。与trypsin不同，Lys-N对变性剂的抵抗力更强，在70°C时仍保持稳定。由Lys-N消化产生的肽使用 ETD 碎裂产生更多的c离子[14]。因此，可用于分析PTM、识别C端多肽以及从头测序[14-15]。
Pepsin
Pepsin即胃蛋白酶，最佳pH范围为1-4，可特异性裂解色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和亮氨酸（Leu）[12]。由于它在较低pH下具有高酶活性和广泛特异性，因此它比其他蛋白酶更适合用于基于MS的二硫化物分析[16-17]。Pepsin还广泛用于氢-氘交换 ( HDX ) 的结构质谱研究，因为在低pH值下酰胺氘的回交换速率最小[18-19]。
Proteinase K
Proteinase K因对角蛋白（keratin）有较强的水解能力而得名[20]，偏好在疏水性和芳香基氨基酸残基处进行切割[21]，没有显著的氨基酸特异性，最佳酶活性在pH 7.5-12之间。 低浓度的Proteinase K可用于限制性蛋白酶切-质谱技术（LiP-MS）检测蛋白质结构变化。
Tips：PEAKS®内置多种常见蛋白酶信息，且支持用户自定义酶，在同一个分析中，兼容单一酶切数据和多酶联合酶切数据类型。
参考文献
1. Yuming J., Devasahayam A., Dina S., Jesse G. M. et al. Comprehensive Overview of Bottom-Up Proteomics Using Mass Spectrometry. ACS Measurement Science Au, 2024,4(4), 338-417. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsmeasuresciau.3c00068
2. Blank-Landeshammer, B.; Teichert, I.; Märker, R.; Nowrousian, M.; Kück, U.; Sickmann, A. Combination of Proteogenomics with Peptide. mBio 2019, 10 (5). https://doi.org/10.1128/mbio.02367-19
3. Yang, H.; Li, Y.-C.; Zhao, M.-Z.; Wu, F.-L.; Wang, X.; Xiao, W.-D.; Wang, Y.-H.; Zhang, J.-L.; Wang, F.-Q.; Xu, F.; Zeng, W.-F.; Overall, C. M.; He, S.-M.; Chi, H.; Xu, P. Precision. Mol Cell Proteomics 2019, 18 (4), 773–785. https://doi.org/10.1074/mcp.tir118.000918.
4.Vanuopadath, M.; Sajeev, N.; Murali, A. R.; Sudish, N.; Kangosseri, N.; Sebastian, I. R.; Jain, N. D.; Pal, A.; Raveendran, D.; Nair, B. G.; Nair, S. S. Mass Spectrometry-Assisted Venom Profiling of Hypnale Hypnale Found in the Western Ghats of India Incorporating de Novo Sequencing Approaches. Int J Biol Macromol 2018, 118 (Pt B), 1736–1746. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.07.016.
5.Vanuopadath, M.; Raveendran, D.; Nair, B. G.; Nair, S. S. Venomics and Antivenomics of Indian Spectacled Cobra (Naja Naja) from the Western Ghats. Acta Tropica 2022, 228, 106324. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2022.106324.
6.Guthals, A.; Clauser, K. R.; Frank, A. M.; Bandeira, N. Sequencing-Grade De Novo Analysis of MS/MS Triplets (CID/HCD/ETD) From Overlapping Peptides. J. Proteome Res. 2013, 12 (6), 2846–2857. https://doi.org/10.1021/pr400173d.
7. Vandermarliere, E.; Mueller, M.; Martens, L. Getting Intimate with Trypsin, the Leading Protease in Proteomics. Mass Spec Rev 2013, 32 (6), 453–465. https://doi.org/10.1002/mas.21376.
8.Ingrosso, D.; Fowler, A. V.; Bleibaum, J.; Clarke, S. Specificity of Endoproteinase Asp-N (Pseudomonas Fragi): Cleavage at Glutamyl Residues in Two Proteins. Biochem Biophys Res Commun 1989, 162 (3), 1528–1534. https://doi.org/10.1016/0006-291x(89)90848-6.
9.Giansanti, P.; Tsiatsiani, L.; Low, T. Y.; Heck, A. J. R. Six Alternative Proteases for Mass Spectrometry-Based Proteomics Beyond Trypsin. Nat Protoc 2016, 11 (5), 993–1006. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.057.
10.Wilhelm, M.; Schlegl, J.; Hahne, H.; Gholami, A. M.; Lieberenz, M.; Savitski, M. M.; Ziegler, E.; Butzmann, L.; Gessulat, S.; Marx, H.; Mathieson, T.; Lemeer, S.; Schnatbaum, K.; Reimer, U.; Wenschuh, H.; Mollenhauer, M.; Slotta-Huspenina, J.; Boese, J.-H.; Bantscheff, M.; Gerstmair, A.; Faerber, F.; Kuster, B. Mass-Spectrometry-Based Draft of the Human Proteome. Nature 2014, 509 (7502), 582–587. https://doi.org/10.1038/nature13319.
11.Guo, X.; Trudgian, D. C.; Lemoff, A.; Yadavalli, S.; Mirzaei, H. Confetti: A Multiprotease Map of the HeLa Proteome for Comprehensive Proteomics. Mol Cell Proteomics 2014, 13 (6), 1573–1584. https://doi.org/10.1074/mcp.m113.035170.
12. Tsiatsiani, L.; Heck, A. J. R. Proteomics Beyond Trypsin. FEBS J 2015, 282 (14), 2612–2626. https://doi.org/10.1111/febs.13287.
13.Huesgen, P. F.; Lange, P. F.; Rogers, L. D.; Solis, N.; Eckhard, U.; Kleifeld, O.; Goulas, T.; Gomis-Rüth, F. X.; Overall, C. M. LysargiNase Mirrors Trypsin for Protein C-Terminal and Methylation-Site Identification. Nat Methods 2014, 12 (1), 55–58. https://doi.org/10.1038/nmeth.3177.
14.Taouatas, N.; Drugan, M. M.; Heck, A. J. R.; Mohammed, S. Straightforward Ladder Sequencing of Peptides Using a Lys-N Metalloendopeptidase. Nat Methods 2008, 5 (5), 405–407. https://doi.org/10.1038/nmeth.1204.
15.Raijmakers, R.; Neerincx, P.; Mohammed, S.; Heck, A. J. R. Cleavage Specificities of the Brother and Sister Proteases Lys-C and Lys-N. Chem Commun (Camb) 2010, 46 (46), 8827–8829. https://doi.org/10.1039/c0cc02523b.
16. Gorman, J. J.; Wallis, T. P.; Pitt, J. J. Protein Disulfide Bond Determination by Mass Spectrometry. Mass Spectrom Rev 2002, 21 (3), 183–216. https://doi.org/10.1002/mas.10025.
17. Liu, F.; van Breukelen, B.; Heck, A. J. R. Facilitating Protein Disulfide Mapping by a Combination of Pepsin Digestion, Electron Transfer Higher Energy Dissociation (EThcD), and a Dedicated Search Algorithm SlinkS. Mol Cell Proteomics 2014, 13 (10), 2776–2786. https://doi.org/10.1074/mcp.o114.039057.
18.Jones, L. M.; Zhang, H.; Vidavsky, I.; Gross, M. L. Online, High-Pressure Digestion System for Protein Characterization by Hydrogen/Deuterium Exchange and Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2010, 82 (4), 1171–1174. https://doi.org/10.1021/ac902477u.
19.Kostyukevich, Y.; Acter, T.; Zherebker, A.; Ahmed, A.; Kim, S.; Nikolaev, E. Hydrogen/Deuterium Exchange in Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews 2018, 37 (6), 811–853. https://doi.org/10.1002/mas.21565.
20.Ebeling, W.; Hennrich, N.; Klockow, M.; Metz, H.; Orth, H. D.; Lang, H. Proteinase K from Tritirachium Album Limber. Eur J Biochem 1974, 47 (1), 91–97. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1974.tb03671.x.
21. Saenger, W. Proteinase K. In Handbook of Proteolytic Enzymes; Elsevier, 2013; pp 3240–3242. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/b978-0-12-382219-2.00714-6.
蛋白质组实验中常见的一些蛋白酶见表1，此部分内容参考Jesse G. Meyer等[1]的最新综述整理。酶的选择主要取决于应用场景。一般来说，对于简单的蛋白质组定性定量，通常仅使用trypsin即可。然而，对于未知序列的蛋白，则必须借助多酶联合酶切的方式，通过从头测序技术完成蛋白序列的组装[2-6]。
表1 常见蛋白酶及特点
(表格参考)Trypsin
胰蛋白酶（trypsin），特异性强、效率高、成本低、适用性广，是蛋白质组学实验中最常用的酶[7]。胰蛋白酶通常在碱性氨基酸Arg和Lys的C末端切割，但如果后面紧邻脯氨酸（R/KP）则一般不切。胰蛋白酶产生的多肽长度、疏水性均非常适合色谱分离、MS的碎裂和采集，谱图易于进行序列鉴定。尽管如此，理论上胰酶也只能覆盖从基因组预测的蛋白质组的一小部分。对于R和K密集切相邻较近的蛋白，会产生大量短肽，而在缺乏R/K的蛋白质区域中，会产生过长的肽段。
Lys-C
Lys-C参与切割赖氨酸的羧基末端。与trypsin一样，其活性所需的最佳pH范围是7-9。Lys-C的一个主要优点是在变性剂体系中（如8M尿素）也可以保持活性。trypsin切割Lys的效率低于Arg，因此，为了蛋白水解更加充分，减少漏切，Lys-C通常与trypsin同时使用。α-lytic
基于酵母蛋白质组的水解多肽分布发现，α-裂解蛋白酶（ALP）的野生型（WALP）对丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸等较小的脂肪族氨基酸具有显著特异性，此外对苏氨酸和丝氨酸也有一定的特异性。突变型（MALP）对蛋氨酸、苯丙氨酸等稍大的氨基酸具有特异性，值得注意的是，相较于异亮氨酸，对亮氨酸更有偏向性。
Glu-C
Glu-C（也称V8）蛋白酶，是一种从金黄色葡萄球菌223获得的丝氨酸蛋白酶，在谷氨酸和天冬氨酸的C端切割。
Asp-N
Asp-N催化天冬氨酸残基N端肽键的水解。该酶的最佳反应pH值介于4-9之间。由于它属于金属蛋白酶，使用Asp-N时应避免使用螯合剂（如EDTA）作为缓冲液。研究还表明，当蛋白水解缓冲液中存在表面活性剂时，Asp-N会在谷氨酸的氨基末端切割[8]。Asp-N 的漏切比较多[9]。
Chymotrypsin
Chymoreypsin在疏水性氨基酸 Phe、Trp、Tyr和Met和Leu 残基的C端进行切割。由于膜蛋白的跨膜区通常缺乏trypsin切割位点，因此该酶可与具有更多疏水性残基的膜蛋白配合试用[9-11]。
Arg-C
Arg-C是主要水解C端Arg残基，少量水解Lys残基，产生的肽通常比trypsin更长。Arg-C经常与其他蛋白酶一起使用，以改进定性蛋白质组数据并用于研究翻译后修饰[12]。
Ulilysin
Ulilysin（即LysargiNase）可以视作trypsin的镜像酶，可特异性地切割Lys和Arg残基的N端。因此，它能够发现使用trypsin无法观察到的C端多肽。此外，它还可以切割修饰氨基酸，例如甲基化或二甲基化的Arg和Lys[13]。
Lys-N
Lys-N切割Lys的N端，在pH=9.0时活性最高。与trypsin不同，Lys-N对变性剂的抵抗力更强，在70°C时仍保持稳定。由Lys-N消化产生的肽使用 ETD 碎裂产生更多的c离子[14]。因此，可用于分析PTM、识别C端多肽以及从头测序[14-15]。
Pepsin
Pepsin即胃蛋白酶，最佳pH范围为1-4，可特异性裂解色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和亮氨酸（Leu）[12]。由于它在较低pH下具有高酶活性和广泛特异性，因此它比其他蛋白酶更适合用于基于MS的二硫化物分析[16-17]。Pepsin还广泛用于氢-氘交换 ( HDX ) 的结构质谱研究，因为在低pH值下酰胺氘的回交换速率最小[18-19]。
Proteinase K
Proteinase K因对角蛋白（keratin）有较强的水解能力而得名[20]，偏好在疏水性和芳香基氨基酸残基处进行切割[21]，没有显著的氨基酸特异性，最佳酶活性在pH 7.5-12之间。 低浓度的Proteinase K可用于限制性蛋白酶切-质谱技术（LiP-MS）检测蛋白质结构变化。
Tips：PEAKS®内置多种常见蛋白酶信息，且支持用户自定义酶，在同一个分析中，兼容单一酶切数据和多酶联合酶切数据类型。
参考文献
1. Yuming J., Devasahayam A., Dina S., Jesse G. M. et al. Comprehensive Overview of Bottom-Up Proteomics Using Mass Spectrometry. ACS Measurement Science Au, 2024,4(4), 338-417. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsmeasuresciau.3c00068
2. Blank-Landeshammer, B.; Teichert, I.; Märker, R.; Nowrousian, M.; Kück, U.; Sickmann, A. Combination of Proteogenomics with Peptide. mBio 2019, 10 (5). https://doi.org/10.1128/mbio.02367-19
3. Yang, H.; Li, Y.-C.; Zhao, M.-Z.; Wu, F.-L.; Wang, X.; Xiao, W.-D.; Wang, Y.-H.; Zhang, J.-L.; Wang, F.-Q.; Xu, F.; Zeng, W.-F.; Overall, C. M.; He, S.-M.; Chi, H.; Xu, P. Precision. Mol Cell Proteomics 2019, 18 (4), 773–785. https://doi.org/10.1074/mcp.tir118.000918.
4.Vanuopadath, M.; Sajeev, N.; Murali, A. R.; Sudish, N.; Kangosseri, N.; Sebastian, I. R.; Jain, N. D.; Pal, A.; Raveendran, D.; Nair, B. G.; Nair, S. S. Mass Spectrometry-Assisted Venom Profiling of Hypnale Hypnale Found in the Western Ghats of India Incorporating de Novo Sequencing Approaches. Int J Biol Macromol 2018, 118 (Pt B), 1736–1746. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.07.016.
5.Vanuopadath, M.; Raveendran, D.; Nair, B. G.; Nair, S. S. Venomics and Antivenomics of Indian Spectacled Cobra (Naja Naja) from the Western Ghats. Acta Tropica 2022, 228, 106324. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2022.106324.
6.Guthals, A.; Clauser, K. R.; Frank, A. M.; Bandeira, N. Sequencing-Grade De Novo Analysis of MS/MS Triplets (CID/HCD/ETD) From Overlapping Peptides. J. Proteome Res. 2013, 12 (6), 2846–2857. https://doi.org/10.1021/pr400173d.
7. Vandermarliere, E.; Mueller, M.; Martens, L. Getting Intimate with Trypsin, the Leading Protease in Proteomics. Mass Spec Rev 2013, 32 (6), 453–465. https://doi.org/10.1002/mas.21376.
8.Ingrosso, D.; Fowler, A. V.; Bleibaum, J.; Clarke, S. Specificity of Endoproteinase Asp-N (Pseudomonas Fragi): Cleavage at Glutamyl Residues in Two Proteins. Biochem Biophys Res Commun 1989, 162 (3), 1528–1534. https://doi.org/10.1016/0006-291x(89)90848-6.
9.Giansanti, P.; Tsiatsiani, L.; Low, T. Y.; Heck, A. J. R. Six Alternative Proteases for Mass Spectrometry-Based Proteomics Beyond Trypsin. Nat Protoc 2016, 11 (5), 993–1006. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.057.
10.Wilhelm, M.; Schlegl, J.; Hahne, H.; Gholami, A. M.; Lieberenz, M.; Savitski, M. M.; Ziegler, E.; Butzmann, L.; Gessulat, S.; Marx, H.; Mathieson, T.; Lemeer, S.; Schnatbaum, K.; Reimer, U.; Wenschuh, H.; Mollenhauer, M.; Slotta-Huspenina, J.; Boese, J.-H.; Bantscheff, M.; Gerstmair, A.; Faerber, F.; Kuster, B. Mass-Spectrometry-Based Draft of the Human Proteome. Nature 2014, 509 (7502), 582–587. https://doi.org/10.1038/nature13319.
11.Guo, X.; Trudgian, D. C.; Lemoff, A.; Yadavalli, S.; Mirzaei, H. Confetti: A Multiprotease Map of the HeLa Proteome for Comprehensive Proteomics. Mol Cell Proteomics 2014, 13 (6), 1573–1584. https://doi.org/10.1074/mcp.m113.035170.
12. Tsiatsiani, L.; Heck, A. J. R. Proteomics Beyond Trypsin. FEBS J 2015, 282 (14), 2612–2626. https://doi.org/10.1111/febs.13287.
13.Huesgen, P. F.; Lange, P. F.; Rogers, L. D.; Solis, N.; Eckhard, U.; Kleifeld, O.; Goulas, T.; Gomis-Rüth, F. X.; Overall, C. M. LysargiNase Mirrors Trypsin for Protein C-Terminal and Methylation-Site Identification. Nat Methods 2014, 12 (1), 55–58. https://doi.org/10.1038/nmeth.3177.
14.Taouatas, N.; Drugan, M. M.; Heck, A. J. R.; Mohammed, S. Straightforward Ladder Sequencing of Peptides Using a Lys-N Metalloendopeptidase. Nat Methods 2008, 5 (5), 405–407. https://doi.org/10.1038/nmeth.1204.
15.Raijmakers, R.; Neerincx, P.; Mohammed, S.; Heck, A. J. R. Cleavage Specificities of the Brother and Sister Proteases Lys-C and Lys-N. Chem Commun (Camb) 2010, 46 (46), 8827–8829. https://doi.org/10.1039/c0cc02523b.
16. Gorman, J. J.; Wallis, T. P.; Pitt, J. J. Protein Disulfide Bond Determination by Mass Spectrometry. Mass Spectrom Rev 2002, 21 (3), 183–216. https://doi.org/10.1002/mas.10025.
17. Liu, F.; van Breukelen, B.; Heck, A. J. R. Facilitating Protein Disulfide Mapping by a Combination of Pepsin Digestion, Electron Transfer Higher Energy Dissociation (EThcD), and a Dedicated Search Algorithm SlinkS. Mol Cell Proteomics 2014, 13 (10), 2776–2786. https://doi.org/10.1074/mcp.o114.039057.
18.Jones, L. M.; Zhang, H.; Vidavsky, I.; Gross, M. L. Online, High-Pressure Digestion System for Protein Characterization by Hydrogen/Deuterium Exchange and Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2010, 82 (4), 1171–1174. https://doi.org/10.1021/ac902477u.
19.Kostyukevich, Y.; Acter, T.; Zherebker, A.; Ahmed, A.; Kim, S.; Nikolaev, E. Hydrogen/Deuterium Exchange in Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews 2018, 37 (6), 811–853. https://doi.org/10.1002/mas.21565.
20.Ebeling, W.; Hennrich, N.; Klockow, M.; Metz, H.; Orth, H. D.; Lang, H. Proteinase K from Tritirachium Album Limber. Eur J Biochem 1974, 47 (1), 91–97. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1974.tb03671.x.
21. Saenger, W. Proteinase K. In Handbook of Proteolytic Enzymes; Elsevier, 2013; pp 3240–3242. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/b978-0-12-382219-2.00714-6.
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