编者按

在单细胞空间多组学时代，尽管新技术不断涌现，单细胞转录组测序仍然是揭示复杂疾病分子机制的强大工具，是找寻疾病靶点的关键手段之一。本文将介绍一篇今年发表的关于原发性胆汁性胆管炎的单细胞转录组研究文献，通过详细解析该研究的设计思路和方法，带大家领略如何利用单细胞转录组测序技术发表高分文献。

研究背景

原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种以多系免疫失调为特征的慢性自身免疫性肝病，可导致肝脏炎症、纤维化甚至肝硬化。由于传统检测方法的局限性，PBC的局部肝脏免疫发病机制尚未完全阐明。

文章详情

文章题目：Single-cell RNA sequencing reveals the pro-inflammatory roles of liver-resident Th1-like cells in primary biliary cholangitis
中文题目：单细胞RNA测序揭示肝脏驻留Th1样细胞在原发性胆汁性胆管炎中的促炎作用
发表时间：2024.10
期刊名称：Nature Communications
影响因子：14.7
实验平台：10X Genomics单细胞转录组测序
DOI：10.1038/s41467-024-53104-9

技术路线

为了方便各位老师快速掌握研究思路，小编绘制了文章的研究框架图，供各位观赏：

研究结果

1.PBC患者肝脏和PBMC的单细胞转录组图谱

为了阐明PBC患者的浸润型免疫细胞特性，对5名未接受熊去氧胆酸（UDCA）治疗且处于Nakanuma分期I~II期的PBC患者、5名肝血管瘤患者（肝脏健康对照组）以及5名健康供者（PBMC健康对照组）的肝脏组织和外周血单核细胞（PBMC）进行单细胞转录组测序和细胞注释。与对照组相比，PBC中免疫细胞亚群分布的变化在肝脏和PBMC之间并未表现出一致的模式。细胞因子评分和炎症评分结果表明，PBC患者的肝脏显示出增强的炎症反应，而在外周血中则没有这种现象。因此，我们将研究重点放在探索PBC中肝细胞的病理特征上。

Fig.1 PBC 患者肝脏和 PBMC 的单细胞转录组图谱

2.胆管细胞和肝星状细胞在PBC中表现出炎症和基质重塑基因表达增加

对肝脏中的非免疫细胞重新聚类，发现了一簇主要来源于PBC组的活化星状细胞，可能在促进细胞外基质重塑并最终导致PBC肝纤维化的过程中发挥关键作用。在PBC患者的胆管细胞中，与胆管细胞生理功能相关的多个通路下调，炎症相关基因及通路上调和激活，暗示胆管细胞可能进入衰老状态并参与了胆管的炎症反应。细胞通讯分析和免疫荧光染色实验发现，在炎症微环境中，高表达CCR7的初始T细胞和B细胞可能被星状细胞直接招募到局部炎症区域，并分别分化为辅助T细胞和浆细胞。衰老的胆管细胞和活化的星状细胞在放大炎症信号和促进PBC肝纤维化的过程中发挥了不可或缺的作用。

Fig.2 PBC患者肝脏非免疫细胞的特点

3. PBC肝脏的库普弗细胞清除功能降低，炎症功能增强

在髓系细胞中，CD14+单核细胞的比例减少，而肝脏驻留的库普弗细胞比例增加。尽管PBC患者肝脏中的单核细胞数量减少，但库普弗细胞的细胞因子评分以及促炎基因如IL1B和CXCL2的表达却增加，同时TNF也显示出上升趋势。库普弗细胞中清道夫功能相关基因表达下调，说明库普弗细胞增强的促炎作用可能加剧肝脏局部的炎症反应，而其清道夫功能的抑制可能减缓衰老胆管细胞和活化星状细胞的清除过程。

Fig.3 PBC患者肝髓系细胞的特征

4. PBC患者肝内T细胞表现出增强的促炎功能和降低的细胞毒性

PBC组中的调节性T细胞（Treg）比例增加，与对照组比较发现，促免疫与抑制免疫的功能基因均被激活，说明PBC患者的Treg细胞处于异常激活状态。具有强烈促炎特性的Th1样细胞比例显著增加，CX3CR1+CD8+T细胞和CX3CR1+NK细胞的细胞毒性功能受到抑制。细胞毒性功能受损可能会阻碍衰老胆管细胞和活化星状细胞的清除，从而加剧疾病的发展。细胞通讯分析发现经典树突状细胞（cDCs）可能通过激活Th1样细胞而在PBC的发展中扮演不可或缺的角色。总体而言，Th1样细胞在PBC中发挥了主导性的促炎作用。

Fig.4 PBC 患者肝脏T细胞的特征

5. 促炎性Th1样细胞仅限于肝脏组织，并与疾病严重程度相关

Th1样细胞表达了与组织驻留相关的基因，而几乎不表达与T细胞归巢相关的基因，表明其具有组织驻留特征。对PBC患者肝脏进行免疫荧光染色发现，组织驻留的Th1样细胞参与了PBC的发展，并促进了肝组织的炎症和纤维化进程。转录因子分析（SCENIC）发现在Th1样细胞中最特异性激活的转录因子在PBC组中进一步增强，包括RUNX1和STAT1，这表明RUNX1和STAT1的激活可能在Th1样细胞效应功能中发挥重要作用。

Fig.5 PBC患者肝脏驻留Th1样细胞的特征

6. 促炎性Th1样细胞在PBC小鼠肝脏中扩增

用2-辛.炔酸与牛血清白蛋白（2OA-BSA）偶联物免疫的PBC小鼠会出现典型的门静脉CD4+和CD8+T细胞浸润表型。对这种模型和对照小鼠肝脏组织进行单细胞转录组测序，发现模型组中髓系细胞和T细胞的比例增加，而非免疫细胞如胆管细胞和内皮细胞的比例减少，并且胆管细胞和星状细胞可能被TNF、IL1B和IFNG等促炎因子激活，并产生多种趋化因子以招募免疫细胞来放大炎症信号。高表达Ifng的Th1样细胞群体有增加的趋势，并具有组织驻留特性，与人肝脏中的Th1样细胞有相似的转录调控特征。流式细胞术分析发现具有组织驻留表面分子特征的CD4+T细胞在疾病模型小鼠的肝脏中扩增。这些细胞通过分泌IFNγ表现出独特的Th1样特性和促炎能力，并参与了胆管炎发展，可能与先前报道的组织驻留记忆T细胞有所重叠。

Fig.6 PBC小鼠肝脏中Th1样细胞的鉴定和特征

7. 阻断JAK/STAT通路可减轻PBC小鼠的胆管损伤并改善肝脏驻留的Th1样细胞

研究者发现JAK/STAT通路可能参与疾病发展，因此假设巴瑞替尼（一种已被批准用于治疗类风湿关节炎的JAK1/JAK2抑制剂）可能阻断由Th1样细胞引起的免疫紊乱。对PBC小鼠治疗2周后发现，门静脉区域的炎症细胞浸润明显减少，胆管细胞坏死也有所缓解。该药物显著抑制了T细胞的扩张，局部IFNγ和TNFα蛋白水平也显著降低。与未治疗组比较T细胞比例差异发现，肝内炎症的缓解与IFNγ分泌的Th1样细胞数量减少相关，这种治疗效果更可能是由CD69+肝驻留细胞群提供的。这些结果表明，巴瑞替尼能够缓解由2OA-BSA免疫的小鼠胆管炎模型中的症状。

Fig.7 巴瑞替尼对PBC小鼠胆管炎的影响

主要结论

本研究利用单细胞转录组测序技术解析了PBC患者的分子机制，揭示了胆管细胞和肝星状细胞参与了肝脏炎症和纤维化的过程。此外，库普弗细胞显示出促炎因子水平的增加和吞噬功能相关基因表达的减少，而T细胞则表现出促炎因子水平的增强以及细胞毒性相关基因表达的降低。有趣的是，在PBC患者和PBC小鼠模型的肝脏中识别出一个具有JAK-STAT激活的肝脏驻留Th1样细胞群体。阻断JAK-STAT通路可以缓解肝脏炎症并在PBC小鼠模型中消除肝脏驻留的Th1样细胞。这些结果扩展了对PBC病理机制的理解，并为PBC患者的治疗提供了潜在靶点。

参考文献

Jin, Ciliang et al. “Single-cell RNA sequencing reveals the pro-inflammatory roles of liver-resident Th1-like cells in primary biliary cholangitis.” Nature communications vol. 15,1 8690. 7 Oct. 2024.