CloudReady生物反应器助力进行大肠杆菌发酵生产慢病毒载体四质粒
2024-12-02 来源:本站 点击次数:447引言
质粒DNA的生产依赖于基因重组技术，将目的基因和其他辅助元件连接形成共价闭合环状结构，通过大肠杆菌高密度发酵、纯化生产制备。随着CGT和mRNA等生物制药技术的飞速发展，质粒DNA作为关键原料的需求急剧增加。
四质粒系统是一种基于HIV-1病毒改造的慢病毒载体系统，由转移质粒、包装质粒、包膜蛋白质粒及Rev表达质粒组成，各质粒协同作用，共同完成假型慢病毒颗粒的包装与感染过程。该系统在基因治疗和临床医学研究中具有广泛应用。
本研究在CloudReady®(1.5L) 4联云平台生物反应器中系统探究不同补料速度及方式对基于慢病毒载体的四质粒系统在大肠杆菌上发酵生产质粒DNA的影响，通过三种不同的补料方式，显著提升了质粒DNA的产率，为细胞与基因治疗（CGT）及mRNA疫苗/药物的产业化提供了重要技术支持。
材料与方法
实验场所：
迪必尔生物 应用技术与工程研究中心（CARE）
菌株：
分别携带rev（4180bp）、fmc63(11922bp)、pol和gag（8890bp）、vsvg(5822bp)的四种大肠杆菌stbl3感受态细胞
检测方法：
取发酵液100μL，经离心去上清后，使用TIANGEN小提试剂盒提取质粒DNA，并通过超微量分光光度计测定质粒浓度。同时，采用实时荧光定量PCR仪检测质粒的完整性，确保无丢失现象发生（表1）。
反应器控制器及罐体：
CloudReady® + 1.5L 玻璃罐体×4
图1 CloudReady云平台生物反应器16联
软件系统：
D2MS(设备和数据管理系统, Device & Data management system）Pro
实验过程及结果
本研究在实验室成熟的发酵培养基配方基础上进行，严格控制各项参数（如表2所示）。为了优化质粒产量，我们尝试了三种不同的补料策略：补料关联DO_PV、恒速补料和时间序列补料。
表2 控制参数
(1) 补料关联DO_PV
实验首先进行R1、R2的发酵实验，按照补料泵关联DO_PV值的方式进行补料（图2），并且设置搅拌通气只升不降。这种控制方式是根据DO_PV值的开关补料，具体逻辑是：DO_PV值高于设定的30%后，补料泵以10mL/h的速度运转；DO_PV值低于设定的30%后，停止补料，这时溶氧控制器会调高搅拌速度、通气量以增大DO。一般情况下，DO_PV值上升意味着底物的缺失，因此检测DO_PV值的变化是可以较好的为菌株流加适量的底物。
然而这批实验R1、R2在开启补料后DO并未下降（图3），反而是持续升高，导致补料泵持续运转。推测可能是菌株在溶氧反弹后代谢发生变化，这时较快的补料速度反而可能有抑制作用。
图2 补料关联DO_PV
图3 R1、R2溶氧曲线
(2) 恒速补料
上一批实验溶氧未下降导致补料泵持续补料，这批实验改用较慢的速度1mL/h恒速补料观察菌株的生长状况和质粒产量。结果显示（图4），20.5h后四个菌株OD600没有明显上升，但质粒产量有持续增长，且qPCR检测质粒无丢失现象；R2、R4在52h观察到质粒浓度下降的情况。
图4 菌株OD600和质粒浓度变化
(3) 时间序列补料
上批恒速补料菌株OD600没有明显增长，因此本批次增大补料速度，开启补料后按补料开始的相对时间进行梯度补料（图5）。图6是此次实验四个菌株OD600和质粒浓度变化。本批次增大补料速度后四个菌株OD600和质粒浓度都有持续升高，最终的菌株密度和质粒产量也较上批恒速补料有所提高，且样品QPCR检测无丢失现象。批次运行46h下罐，培养过程中R1-R4的最大OD600分别为36.1、23.9、32、27.8，R1-R4的最大质粒浓度分别为231.5、154、281.89、296.33mg/L，其中R2的最大OD600和质粒浓度相比R1、R3、R4都是最低的，R1的最大OD600最高，R4的最大质粒浓度最高。
图6 菌株OD600和质粒浓度变化
结论
本研究通过平行生物反应器平台，系统地评估不同补料方式和速度在大肠杆菌发酵生产质粒DNA过程中的应用效果，发现补料速度较为合适的时间序列补料策略能够有效提升质粒DNA的产率和稳定性。其中，携带vsvg的大肠杆菌在该策略下，最大质粒浓度达到了296.33mg/L，这一结果充分验证了该策略的有效性和可行性。本研究不仅为大肠杆菌发酵生产质粒DNA提供了重要的技术参考，同时也进一步验证了平行生物反应器在发酵工艺优化的重要性。