摘要
本研究旨在探讨绿色荧光蛋白（GFP）作为标志基因在快速筛选基因转染阳性细胞中的应用。通过构建基于逆转录病毒的转化体系，将GFP基因导入外周血单个核细胞（PBMC），并利用流式细胞仪检测基因转移效率。实验结果显示，GFP能有效标记转染阳性细胞，为基因治疗中的细胞筛选提供了一种快速、准确的方法。

引言

基因治疗作为一种前沿的生物医学技术，为遗传性疾病和肿瘤性疾病的治疗提供了新的希望。基因转移是基因治疗的技术基础，而如何高效、准确地筛选基因转染阳性细胞则是基因治疗成功与否的关键。传统的筛选方法，如基于药物抗性的筛选，虽然有效，但耗时较长，且可能对细胞产生毒性影响。因此，寻找一种快速、安全的筛选方法显得尤为重要。

绿色荧光蛋白（GFP）作为一种生物发光蛋白，能够在无需额外底物或辅因子的条件下发出绿色荧光。这一特性使其在生物学研究中得到了广泛应用，特别是在细胞成像和基因表达监测方面。近年来，越来越多的研究开始探索将GFP作为标志基因用于基因转染阳性细胞的筛选。通过构建含有GFP基因的载体，并将其导入靶细胞，可以利用GFP发出的荧光快速识别转染阳性细胞。这种方法不仅操作简单、耗时短，而且不会对细胞产生毒性影响，因此在基因治疗中具有广阔的应用前景。

本研究旨在探讨GFP作为标志基因在快速筛选基因转染阳性细胞中的应用，并构建基于逆转录病毒的转化体系，将GFP基因导入外周血单个核细胞（PBMC）。通过流式细胞仪检测基因转移效率，评估GFP作为筛选标志的可行性和准确性，为基因治疗中的细胞筛选提供一种新的方法。

材料与方法

1. 实验材料

• 实验试剂：某品牌DMEM培养基、某品牌胎牛血清（FBS）、某品牌PBS、某品牌胰酶、某品牌逆转录病毒载体（含GFP基因、HSV-TK基因和NeoR基因）、某品牌polybrene、某品牌G418、某品牌淋巴细胞分离液等。
• 实验仪器：某品牌移液器、某品牌二氧化碳培养箱、某品牌倒置荧光显微镜、某品牌流式细胞仪、某品牌超净工作台、某品牌离心机等。
• 细胞株：外周血单个核细胞（PBMC）。

2. 实验方法

2.1 PBMC的分离和培养

取健康志愿献血者外周血58 mL，肝素抗凝。使用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用PBS洗涤2遍后，悬浮于含某浓度FBS、某浓度IL-2、某浓度PHA-P和某浓度CD3 McAb的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO₂的饱和湿度培养箱中培养35天。

2.2 病毒上清的制备及其滴度测定

将含GFP基因、HSV-TK基因和NeoR基因的逆转录病毒包装细胞在含某浓度G418的DMEM中培养至基本成层后，弃去上清，换用无G418的新鲜培养液继续培养18~24小时，收集上清即为病毒上清。以NIH3T3细胞株检测病毒滴度，病毒效价=集落数×上清稀释倍数（CFU/mL）。

2.3 基因转染

取培养35天的PBMC悬浮于含某浓度polybrene和某浓度IL-2的病毒上清中，孵育812小时后，去除病毒上清及polybrene，加入含20 %FBS的新鲜培养液。12天后，重复上述步骤，继续与病毒上清孵育。如此反复转染23次，转染病毒滴度与细胞比为10:1。

2.4 倒置显微镜观察

取转染后细胞制成细胞悬液，在倒置显微镜下观察细胞生长情况。转换荧光光源，观察GFP发出的绿色荧光，并计数荧光细胞数。

2.5 流式细胞仪分析

取转染细胞，用PE标记的鼠抗人CD3、CD4、CD8和CD19单克隆抗体进行细胞表面抗原标记。参照检测异硫氰酸荧光素（FITC）的常规方法（激发波长475 nm，发射波长490 nm），调整流式细胞仪工作条件至GFP（工作电压525 V）。各管分别获取10000个细胞数，测定不同CD抗原细胞基因转移效率。

2.6 PCR检测外源基因整合

按常规方法进行转染后PBMC基因组DNA提取，以提取的DNA为模板，用NeoR基因引物进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察NeoR基因的整合情况。

结果

1. 病毒上清滴度测定

病毒上清滴度为3.75×10⁶ CFU/mL。

2. PBMC的基因转移

在倒置显微镜下观察，重复转染的PBMC生长良好，膜光滑完整，胞浆丰富，核清晰可见。转换荧光光源后，可见绿色荧光细胞，细胞饱满。进一步观察PE标记的鼠抗人CD单克隆抗体标记的转染后细胞，荧光视野下可见由GFP产生的绿色荧光细胞、PE产生的红色荧光细胞及GFP和PE双标记细胞。

3. FACS测定不同CD抗原细胞基因转移效率

基因转移效率按实验组UR测定值-阴性本底UR测定值计算。结果显示，不同CD抗原细胞中T淋巴细胞基因转移效率较高，转化T细胞中CD4细胞亚群占较大比例，CD8细胞亚群及单核细胞也有一定的基因转移率，B淋巴细胞基因转移率最低。

4. 外源基因在PBMC基因组的整合

应用PCR对转染的PBMC DNA进行NeoR基因鉴定，结果可见NeoR基因790 bp的PCR产物电泳带，表明转染的外周血单个核细胞基因组中有NeoR基因整合。

讨论

本研究通过构建基于逆转录病毒的转化体系，将GFP基因成功导入外周血单个核细胞（PBMC），并利用流式细胞仪检测了基因转移效率。实验结果显示，GFP能有效标记转染阳性细胞，且不同CD抗原细胞的基因转移效率存在差异。其中，T淋巴细胞基因转移效率较高，尤其是CD4细胞亚群。这一结果与之前的研究相符，表明T淋巴细胞在基因治疗中可能具有更高的转染效率和表达水平。

此外，本研究还通过PCR检测了外源基因在PBMC基因组的整合情况。结果显示，NeoR基因成功整合到PBMC基因组中，进一步证实了基因转染的成功。这一结果不仅为GFP作为筛选标志的可行性提供了有力证据，也为后续基因治疗研究提供了重要的实验基础。

在策略上，本研究选择了逆转录病毒作为载体，主要是因为其具有较高的转染效率和安全性。同时，通过引入GFP作为标志基因，实现了对转染阳性细胞的快速筛选。这种方法不仅操作简单、耗时短，而且不会对细胞产生毒性影响，因此在基因治疗中具有广阔的应用前景。

在创新方面，本研究首次将GFP作为标志基因用于外周血单个核细胞的基因转染筛选，并成功构建了基于逆转录病毒的转化体系。这一研究不仅丰富了基因治疗中的细胞筛选方法，也为后续研究提供了新的思路和技术支持。

在应用前景上，GFP作为标志基因在基因治疗中具有广泛的应用潜力。通过构建含有GFP基因的载体，并将其导入靶细胞，可以利用GFP发出的荧光快速识别转染阳性细胞。这种方法不仅适用于外周血单个核细胞，还可用于其他类型的细胞筛选。此外，随着基因治疗技术的不断发展，GFP作为标志基因的应用范围也将进一步扩大。

结论

本研究成功构建了基于逆转录病毒的转化体系，将GFP基因导入外周血单个核细胞，并利用流式细胞仪检测了基因转移效率。实验结果显示，GFP能有效标记转染阳性细胞，为基因治疗中的细胞筛选提供了一种快速、准确的方法。这一研究不仅丰富了基因治疗中的细胞筛选方法，也为后续研究提供了新的思路和技术支持。未来，随着基因治疗技术的不断发展，GFP作为标志基因的应用前景将更加广阔。