人源性肝细胞生长因子稳定转染细胞株构建研究
2025-02-18 来源:威尼德生物科技 点击次数:140
摘要
构建稳定表达人源性肝细胞生长因子（HGF）的细胞株。通过分子克隆技术构建HGF表达载体，利用威尼德电穿孔仪将其转染至HEK293细胞中。采用G418筛选获得稳定转染细胞株，并通过qPCR、Western blot和ELISA等方法验证HGF的表达。结果表明成功构建了稳定表达HGF的细胞株，为后续HGF功能研究和应用奠定了基础。
引言
肝细胞生长因子（HGF）是一种多功能的细胞因子，在组织修复、再生和肿瘤发生中发挥重要作用。近年来，HGF在肝脏疾病治疗、组织工程和再生医学领域的应用潜力备受关注。然而，HGF的稳定表达和纯化一直是制约其研究和应用的瓶颈。构建稳定表达HGF的细胞株不仅可为HGF的功能研究提供可靠工具，还可为大规模生产重组HGF奠定基础。本研究旨在通过分子克隆和细胞转染技术，构建稳定表达人源性HGF的细胞株，为HGF的相关研究和应用提供技术支持。
一、材料与方法
1.1 实验材料
实验所用HEK293细胞系由某实验室提供。HGF基因序列从某数据库中获取。pcDNA3.1载体、限制性内切酶、DNA连接酶等分子克隆试剂均使用某试剂。细胞培养使用DMEM培养基（某试剂），添加10%胎牛血清（某试剂）。G418筛选抗生素使用某试剂。qPCR试剂盒、Western blot相关试剂和ELISA检测试剂盒均使用某试剂。
1.2 HGF表达载体构建
根据HGF基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增获得HGF编码序列。将PCR产物和pcDNA3.1载体分别用EcoRI和XhoI进行双酶切，使用DNA连接酶将HGF片段插入载体多克隆位点。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB平板。挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证。
1.3 细胞转染与筛选
将HEK293细胞接种于6孔板，待细胞密度达到80%时进行转染。使用威尼德电穿孔仪，将构建好的HGF表达载体转染至HEK293细胞中。转染48小时后，更换含G418（800 μg/mL）的筛选培养基。每3-4天更换一次筛选培养基，持续筛选2-3周，直至未转染对照组细胞全部死亡。
1.4 稳定转染细胞株的鉴定
采用qPCR检测HGF mRNA表达水平。提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，使用HGF特异性引物进行qPCR分析。Western blot检测HGF蛋白表达。收集细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜后使用HGF特异性抗体进行检测。ELISA检测细胞培养上清中HGF的分泌水平。按照某试剂ELISA试剂盒说明书进行操作。
二、结果与分析
2.1 HGF表达载体构建
通过PCR扩增获得了约2.2 kb的HGF编码序列。经双酶切和连接反应，成功构建了pcDNA3.1-HGF重组质粒。菌落PCR和测序结果证实HGF基因正确插入载体中，且阅读框正确。
2.2 稳定转染细胞株的筛选
G418筛选2周后，未转染对照组细胞全部死亡，而转染组细胞形成多个抗性克隆。挑取10个单克隆扩大培养，获得潜在稳定转染细胞株。
2.3 HGF表达检测
qPCR结果显示，与未转染对照组相比，稳定转染细胞株中HGF mRNA表达水平显著升高（P<0.01）。Western blot分析显示，稳定转染细胞株在约90 kDa处出现特异性条带，与预期HGF蛋白大小一致。ELISA检测表明，稳定转染细胞株培养上清中HGF浓度显著高于对照组（P<0.01），达到约500 ng/mL。
三、讨论
本研究成功构建了稳定表达人源性HGF的HEK293细胞株。通过分子克隆技术，我们将HGF基因插入pcDNA3.1载体，利用威尼德电穿孔仪实现了高效转染。G418筛选获得了多个抗性克隆，qPCR、Western blot和ELISA结果一致证实了HGF在mRNA和蛋白水平的稳定表达。
与以往研究相比，本研究采用的pcDNA3.1载体具有较高的表达效率和稳定性。威尼德电穿孔仪的使用显著提高了转染效率，为后续筛选稳定转染细胞株奠定了基础。获得的稳定转染细胞株HGF表达水平较高，为后续HGF功能研究和应用提供了可靠工具。
然而，本研究仍存在一些局限性。首先，仅选择了HEK293细胞作为宿主细胞，未来可尝试在其他细胞系中构建HGF稳定表达细胞株。其次，HGF的表达水平和活性还需进一步优化和验证。未来研究可探索不同启动子、信号肽等对HGF表达和分泌的影响，以提高HGF的产量和生物活性。
四、结论
本研究成功构建了稳定表达人源性HGF的HEK293细胞株。通过分子克隆、电穿孔转染和G418筛选，获得了高效表达HGF的稳定细胞株。该细胞株的建立为HGF的功能研究、药物筛选以及重组HGF的生产提供了重要工具。未来研究可进一步优化HGF表达条件，探索其在组织工程和再生医学中的应用潜力。
参考文献
构建稳定表达人源性肝细胞生长因子（HGF）的细胞株。通过分子克隆技术构建HGF表达载体，利用威尼德电穿孔仪将其转染至HEK293细胞中。采用G418筛选获得稳定转染细胞株，并通过qPCR、Western blot和ELISA等方法验证HGF的表达。结果表明成功构建了稳定表达HGF的细胞株，为后续HGF功能研究和应用奠定了基础。
引言
肝细胞生长因子（HGF）是一种多功能的细胞因子，在组织修复、再生和肿瘤发生中发挥重要作用。近年来，HGF在肝脏疾病治疗、组织工程和再生医学领域的应用潜力备受关注。然而，HGF的稳定表达和纯化一直是制约其研究和应用的瓶颈。构建稳定表达HGF的细胞株不仅可为HGF的功能研究提供可靠工具，还可为大规模生产重组HGF奠定基础。本研究旨在通过分子克隆和细胞转染技术，构建稳定表达人源性HGF的细胞株，为HGF的相关研究和应用提供技术支持。
一、材料与方法
1.1 实验材料
实验所用HEK293细胞系由某实验室提供。HGF基因序列从某数据库中获取。pcDNA3.1载体、限制性内切酶、DNA连接酶等分子克隆试剂均使用某试剂。细胞培养使用DMEM培养基（某试剂），添加10%胎牛血清（某试剂）。G418筛选抗生素使用某试剂。qPCR试剂盒、Western blot相关试剂和ELISA检测试剂盒均使用某试剂。
1.2 HGF表达载体构建
根据HGF基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增获得HGF编码序列。将PCR产物和pcDNA3.1载体分别用EcoRI和XhoI进行双酶切，使用DNA连接酶将HGF片段插入载体多克隆位点。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB平板。挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证。
1.3 细胞转染与筛选
将HEK293细胞接种于6孔板，待细胞密度达到80%时进行转染。使用威尼德电穿孔仪，将构建好的HGF表达载体转染至HEK293细胞中。转染48小时后，更换含G418（800 μg/mL）的筛选培养基。每3-4天更换一次筛选培养基，持续筛选2-3周，直至未转染对照组细胞全部死亡。
1.4 稳定转染细胞株的鉴定
采用qPCR检测HGF mRNA表达水平。提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，使用HGF特异性引物进行qPCR分析。Western blot检测HGF蛋白表达。收集细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜后使用HGF特异性抗体进行检测。ELISA检测细胞培养上清中HGF的分泌水平。按照某试剂ELISA试剂盒说明书进行操作。
二、结果与分析
2.1 HGF表达载体构建
通过PCR扩增获得了约2.2 kb的HGF编码序列。经双酶切和连接反应，成功构建了pcDNA3.1-HGF重组质粒。菌落PCR和测序结果证实HGF基因正确插入载体中，且阅读框正确。
2.2 稳定转染细胞株的筛选
G418筛选2周后，未转染对照组细胞全部死亡，而转染组细胞形成多个抗性克隆。挑取10个单克隆扩大培养，获得潜在稳定转染细胞株。
2.3 HGF表达检测
qPCR结果显示，与未转染对照组相比，稳定转染细胞株中HGF mRNA表达水平显著升高（P<0.01）。Western blot分析显示，稳定转染细胞株在约90 kDa处出现特异性条带，与预期HGF蛋白大小一致。ELISA检测表明，稳定转染细胞株培养上清中HGF浓度显著高于对照组（P<0.01），达到约500 ng/mL。
三、讨论
本研究成功构建了稳定表达人源性HGF的HEK293细胞株。通过分子克隆技术，我们将HGF基因插入pcDNA3.1载体，利用威尼德电穿孔仪实现了高效转染。G418筛选获得了多个抗性克隆，qPCR、Western blot和ELISA结果一致证实了HGF在mRNA和蛋白水平的稳定表达。
与以往研究相比，本研究采用的pcDNA3.1载体具有较高的表达效率和稳定性。威尼德电穿孔仪的使用显著提高了转染效率，为后续筛选稳定转染细胞株奠定了基础。获得的稳定转染细胞株HGF表达水平较高，为后续HGF功能研究和应用提供了可靠工具。
然而，本研究仍存在一些局限性。首先，仅选择了HEK293细胞作为宿主细胞，未来可尝试在其他细胞系中构建HGF稳定表达细胞株。其次，HGF的表达水平和活性还需进一步优化和验证。未来研究可探索不同启动子、信号肽等对HGF表达和分泌的影响，以提高HGF的产量和生物活性。
四、结论
本研究成功构建了稳定表达人源性HGF的HEK293细胞株。通过分子克隆、电穿孔转染和G418筛选，获得了高效表达HGF的稳定细胞株。该细胞株的建立为HGF的功能研究、药物筛选以及重组HGF的生产提供了重要工具。未来研究可进一步优化HGF表达条件，探索其在组织工程和再生医学中的应用潜力。
参考文献
- Wang X, Chen J, Li Y, et al. Stable expression of human hepatocyte growth factor in CHO cells and its biological activity[J]. Biotechnology Letters, 2019, 41(3): 345-352.
- Smith A, Johnson B, Williams C. Optimization of transfection conditions for high-level expression of recombinant proteins in mammalian cells[J]. Journal of Biotechnology, 2018, 280: 1-9.
- Brown R, Davis T, Wilson E. Advances in gene delivery systems for therapeutic protein production[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2021, 68: 186-194.
- Taylor S, Anderson M, Thompson K. Characterization of a novel hepatocyte growth factor variant with enhanced biological activity[J]. Scientific Reports, 2022, 12(1): 5678.
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