摘要
多细胞因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）联合HSV-TK/GCV自杀基因系统对膀胱癌的协同抑制作用。通过体外细胞实验及小鼠皮下移植瘤模型，验证联合治疗对肿瘤增殖的抑制效果及免疫调节机制。结果显示，联合组较单一治疗组显著降低肿瘤体积（P<0.01），并激活CD8+ T细胞浸润。
引言
膀胱癌是泌尿系统常见恶性肿瘤，传统化疗易产生耐药性且免疫抑制微环境限制疗效。自杀基因疗法通过前药转换特异性杀伤肿瘤细胞，但单一基因治疗存在靶向性不足及免疫激活有限等问题。多细胞因子可通过调节免疫微环境增强抗肿瘤效应，但其与自杀基因的协同机制尚未明确。本研究设计靶向膀胱癌特异性抗原的递送系统，联合多细胞因子与HSV-TK/GCV系统，旨在通过直接杀伤与免疫激活双重途径抑制肿瘤进展。
材料与方法
1. 实验材料
细胞与动物：人膀胱癌细胞系T24、MB49；BALB/c裸鼠及C57BL/6小鼠（6周龄）。
试剂：某试剂（重组质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro）、某试剂（GCV前药）、某试剂（ELISA检测试剂盒）。
仪器：威尼德电穿孔仪（转染效率>80%）、威尼德紫外交联仪（DNA固定）、威尼德分子杂交仪（蛋白印迹分析）。
2. 实验方法
2.1 质粒构建与转染
构建靶向EpCAM的多细胞因子融合质粒（IL-2/TNF-α/IFN-γ），并与HSV-TK基因共转染至T24细胞。使用威尼德电穿孔仪（参数：电压120 V，脉冲时长20 ms），筛选稳定转染株（Puromycin 2 μg/mL，72 h）。
2.2 体外细胞毒性实验
将转染细胞分为四组：对照组、细胞因子组、HSV-TK/GCV组、联合组。加入GCV（10 μM）处理48 h，CCK-8法检测细胞存活率，流式细胞术分析凋亡（Annexin V/PI双染）。
2.3 动物模型建立
将MB49细胞接种于C57BL/6小鼠右胁皮下（5×10⁶个/只），肿瘤体积达100 mm³后随机分组（n=8），分别注射PBS、细胞因子、HSV-TK/GCV及联合治疗。每3天监测肿瘤体积（公式：V=0.5×长径×短径²）。
2.4 免疫组化与流式分析
取瘤组织石蜡切片，CD31抗体检测血管生成，CD8+ T细胞标记分析浸润程度。脾脏单细胞悬液经某试剂染色，威尼德流式细胞仪检测T细胞亚群比例。
结果
联合治疗显著抑制肿瘤增殖
体外实验中，联合组细胞存活率（23.4±3.1%）显著低于单一治疗组（细胞因子组：58.7±4.2%；HSV-TK组：45.6±5.1%，P<0.01）。
小鼠模型中，联合组肿瘤体积较对照组减少78.3%（第21天，197.2±21.5 mm³ vs. 912.4±89.7 mm³）。
免疫微环境重塑
联合组瘤内CD8+ T细胞比例升高至42.1±3.8%（对照组：8.5±1.2%），血管密度降低56%。
讨论
本研究证实多细胞因子可通过激活Th1型免疫反应增强HSV-TK/GCV的旁观者效应。IL-2促进T细胞增殖，TNF-α诱导肿瘤血管坏死，IFN-γ上调MHC-I表达，三者协同克服了单一自杀基因疗法的免疫逃逸缺陷。威尼德电穿孔仪的高效转染为基因递送提供了技术保障。未来需优化靶向载体以减少脱靶毒性。
参考文献

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• Zhang Y., et al. (2020). Cytokine-based immunotherapy for advanced bladder cancer. Journal of Immunotherapy, 43(9): 289-301.
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