本文要点：目前，细胞焦亡逐渐成为是一种有效增强肿瘤免疫反应和抑制肿瘤生长的新方法，主要诱导方式依赖于化疗药物和光疗，但它们潜在的生物毒性和光毒性限制了其在生物医学中的应用。在此，研究者设计了一种近红外-II发射的焦亡生物调谐器Rd-TTPA，它在超声波照射下诱导焦亡，以实现焦亡增强声动力治疗（SDT）和肿瘤免疫原性细胞死亡（ICD）。得益于其A-π-D1-D2结构增强的供体-受体相互作用，Rd-TTPA可以在常氧（21%O2）和缺氧（2%O2）条件下通过超声照射快速产生超氧自由基（O2-• ）诱导细胞焦亡。焦亡声动力学生物钻克服了化学药物和光敏剂基焦亡长期存在的耐药性和穿透深度有限等弱点。研究表明，Rd-TTPA可以选择性靶向肿瘤细胞线粒体，并具有优异的体内NIR-II荧光成像能力。在NIR-II荧光成像的指导下，用Rd-TTPA给药荷瘤小鼠模型，通过焦亡增强SDT表现出令人满意的抗肿瘤效果。

研究者构建了一种新的A-π-D1-D2型分子Rd-TTPA，其具有增强的D-A相互作用和分子内运动，其中含有罗丹明支架作为电子受体（A）和π共轭体系，噻吩环和三苯胺单元分别作为第一和第二供体（D1，D2），以及可旋转的乙烯基和C-C单键以增加分子内运动（方案1）。在超声波照射下，Rd-TTPA可以在溶液中有效地产生大量的O2-•，使其能够作为声敏化剂。细胞和体内研究证明，Rd-TTPA可通过包含正电荷的结构主动靶向肿瘤细胞的线粒体，并通过SDT产生的ROS诱导细胞焦亡，通过焦亡增强SDT达到良好的抗肿瘤效果。Rd-TTPA还具有优异的NIR-II荧光发射能力（λmax=1000 nm）和较大的斯托克斯位移（340 nm），这更有利于体内精确的肿瘤成像，有助于联合治疗。

方案1. 用于NIR-II成像引导的焦亡增强肿瘤SDT的超声生物调谐器（Rd-TTPA）

首次通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究了Rd-TTPA和Rd-TPA的光学性质。这两种化合物在不同极性的溶剂中表现出稳定的吸收光谱（λabs=635–680）和发射光谱（λem=975–1000）。Rd-TTPA在DMF中的最大吸收带位于660 nm，最大荧光发射带位于1000 nm（图1A）。对于Rd-TPA，吸收和发射最大值分别为358 nm和451 nm（图1B）。与Rd-TPA相比，Rd-TTPA在1000 nm处显示出更长的NIR-II荧光发射带，以及340 nm的巨大斯托克斯位移。大的斯托克斯位移可以有效消除荧光探针自吸收和激发光谱与荧光光谱之间的串扰引起的荧光淬灭现象，提高探针的荧光成像信噪比（SNR），更有利于在生物成像中的应用。Rd-TTPA在PBS中的吸收峰和发射峰分别位于630 nm和940 nm处。Rd-TTPA的摩尔消光系数计算为3640 M-1 cm-1，这表明Rd TTPA在660 nm处具有一定的吸收能力。Rd-TTPA在二氯甲烷中的NIR-II荧光量子产率（QY）高达1.22%，这是参考NIR染料IR-26计算的（QY=0.05%，二氯乙烷），表明Rd-TTPA具有优异的NIR-III窗口成像能力。

接下来，评估了Rd-TTPA在超声（US）照射（3.0 MHz，1.0 W/cm2）下产生ROS的能力。使用DCFH作为溶液中的ROS荧光探针进行初步评估。如图1C所示，在用Rd-TTPA处理的超声波照射下，DCFH在530 nm处的荧光强度值随着时间的增加（0-10分钟）增加了约5.8倍，是相同条件下Rd-TTPA的2.0倍，超过了商用声敏化剂亚甲基蓝（MB）5.4倍。研究者通过使用DHR 123作为O2-•的指示剂和ABDA作为1O2的指示剂，测量了Rd-TTPA是否可以产生超氧自由基（O2-•）或单线态氧（1O2）。研究发现在超声照射（3.0 MHz，1.0 W/cm2）下，用Rd-TTPA处理的DHR 123的荧光强度（535 nm）随着照射时间的变化增加了近8.5倍（图1D和E），而ABDA在380 nm处的UV-Vis吸收值没有显著变化（图1F）。更重要的是，相对于单独的DHR123，即使在360秒的相对较短的暴露时间内，也观察到Rd-TTPA的荧光增强约为7.5倍。考虑到这些发现，它支持Rd-TTPA在超声波照射下能产生大量O2，但不能产生1O2。

研究者评估了Rd-TTPA使用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）在细胞中产生ROS的能力，在ROS存在的情况下，DCFH DA可以被细胞内酯酶立即分解并氧化为发射2′，7'-二氯荧光素（DCF）。Rd-TTPA在488 nm处没有明显的吸收，其荧光强度远弱于在相同波长488 nm处激发的DCF。这些结果表明，Rd-TTPA不会干扰细胞内DCF的绿色荧光信号。如图1G所示，在Rd-TTPA存在的情况下，超声照射下4T1细胞出现亮绿色荧光信号，荧光强度是Rd-TTPA组的8.1倍和US组的6.2倍，表明Rd TTPA具有优异的声动力学特性。对于用Rd-TTPA处理并用超声波照射的4T1细胞，在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）下观察到二氢乙锭（DHE，细胞O2-•的指示剂）的特征性红色荧光（图1H）。相比之下，在Rd-TTPA组或US照射组中没有观察到明显的红色荧光信号。

图2. Rd-TTPA的亚细胞分布和体外抗肿瘤作用

如图2A–C所示，Rd-TTPA的红色通道荧光与MTG（商业线粒体染料）的绿色荧光很好地融合，而Hoechst 33342的蓝色荧光仅能染色细胞核。Rd-TTPA与MTG的Pearson系数为0.90，而Rd-TTPA和Hoechst 33342为0.13（图2B），表明探针主要靶向线粒体。相比之下，Rd-TTPA对LTG（商业溶酶体染料）的皮尔逊系数仅为0.57（图2B），证实了Rd-TTPA靶向线粒体的潜力。

采用MTT法评价Rd-TTPA的体外抗肿瘤作用。如图2D所示，在没有超声波照射的情况下，Rd-TTPA的毒性可以忽略不计，即使Rd-TTPA浓度升至30μM，细胞存活率仍可达90%。然而，在超声照射下，4T1细胞的活性随着Rd-TTPA浓度的增加而降低。Rd-TTPA+US组的IC50值为7.88μM。此外，使用通过活细胞和死细胞染色（钙黄绿素AM和PI）结果证明了Rd-TTPA在体外具有优异的抗肿瘤活性。如图2E所示，包括Rd-TTPA组和US组在内的对照组中仅出现绿色荧光信号，表明Rd-TTPA的细胞毒性可以忽略不计，超声波照射对细胞存活率的影响微不足道。然而，在Rd-TTPA+US组中，有一半的细胞显示出强烈的红色荧光信号，而绿色荧光信号则急剧下降，这表明Rd-TTPA可以作为一种有效的声增敏剂来导致细胞死亡。这些结果证明，Rd-TTPA在细胞中具有优异的声动力学抗肿瘤活性。

图3. 评价Rd-TTPA诱导细胞焦亡的能力

细胞焦亡是由GSDM蛋白家族介导的，该家族包含一个C端抑制结构域和一个N端成孔结构域，后者在炎症性胱天蛋白酶激活后释放，可以在细胞膜上形成孔，导致细胞膜破裂和焦亡的发生。研究者首先使用LSCM观察了超声照射下与Rd-TTPA孵育的4T1细胞的形态变化。在超声波照射10分钟后，发现只有用Rd-TTPA处理的4T1细胞形成了一些气泡状突起，称为细胞质膜染色染料DIO染色的焦亡体（图3A）。此外，Hoechst 33342染色结果显示，在这个过程中，细胞核保持完整，而不是分裂（凋亡的一个标志），这与细胞焦亡的典型特征一致。相比之下，对照细胞没有发现气泡状突起，细胞仅用Rd TTPA或超声波照射处理。因此，研究者认为Rd-TTPA可以在SDT下充当焦亡生物调谐器。为了进一步揭示焦亡激活的途径，对不同处理的4T1细胞进行了蛋白质印迹分析。Caspase-1/Gasdermin-D（GSDMD）被认为是焦亡起始的主要途径。在Rd-TTPA+US组中，caspase-1和GSDMD-N片段的表达水平显著，而在对照组、Rd-TTPA组和US组中没有发现显著差异。Western blot结果表明，超声诱导的O2-•产生通过胱天蛋白酶-1/GSDMD途径启动了细胞焦亡（图3B-D）。由于焦亡过程中产生的GSDMD-N可以触发膜孔的形成并导致IL-1β等炎性细胞因子的释放，因此测量了各组细胞培养基中IL-1β的相对释放量。Rd-TTPA+US组的IL-1β含量高于其他组，这与GSDMD触发细胞膜孔的预期一致（图3E）。此外，随着膜孔的形成，细胞内乳酸脱氢酶（LDH）可能会逐渐释放到细胞外液中，还确定了各组LDH的渗漏情况。与其他组相比，Rd-TTPA+US组LDH的释放增加更为显著（图3F）。这些结果表明，基于Rd TTPA的SDT可以启动caspase-1/GSDMD通路，诱导细胞膜孔的形成，进一步促进细胞焦亡的发生。

研究表明，细胞焦亡可以启动肿瘤特异性免疫，从而介导免疫原性细胞死亡（ICD），是增强肿瘤免疫治疗的有力策略。可以通过检测两个重要标志物CRT和HGMB-1的表达来评估Rd-TTPA诱导细胞焦亡增强ICD的能力。此后，与Rd-TTPA共孵育的4T1细胞在超声照射下在细胞表面显示出显著增加的CRT信号，表明细胞焦亡过程中细胞表面CRT含量增加（图3G）。除CRT外，其他组仅在细胞核中检测到HMGB1，而在超声照射下与Rd-TTPA共孵育的4T1细胞中，HMGB1的表达迁移到整个细胞中。Rd-TTPA+US组细胞质中ATP含量也显著增加。这些结果表明，在超声照射下，Rd-TTPA诱导的细胞焦亡有效地导致ICD并引发适应性免疫反应。

图4. Rd-TTPA在缺氧条件下的抗肿瘤作用

肿瘤缺氧可增强肿瘤对基于ROS的癌症疗法（如PDT和SDT）的抵抗力，导致治疗效果降低。因此，通过在三气体培养箱中创造缺氧条件模拟肿瘤缺氧微环境，从而评估Rd-TTPA是否可以在缺氧条件下诱导焦亡并介导抗肿瘤作用（2%O2，图4A）。DCFH-DA用于评估Rd TTPA在缺氧条件下（含氧量：2%）产生ROS的能力。与Rd-TTPA一起孵育的缺氧4T1细胞显示出DCF的独特绿色荧光特征，而其他组没有出现显著变化（图4D）。此外，还通过DHE染色评估了Rd-TTPA在缺氧条件下产生O2-•的能力。

在超声照射下，缺氧的Rd-TTPA负载的4T1细胞中呈现出明亮的红色荧光，而其他组则显示出稀少的红色荧光（图4D）。Rd-TTPA的缺氧SDT结果与其在常氧条件下的ROS产生曲线一致，证明了Rd-TTPA通过O2依赖性SDT在缺氧肿瘤中起作用的可行性。MTT法用于评估Rd-TTPA的抗肿瘤效率。如图4B所示，在缺氧条件下，Rd-TTPA对4T1细胞的细胞毒性可以忽略不计。在超声照射下，Rd-TTPA在低氧（2%O2）条件下显示出对癌症细胞的剂量依赖性根除，IC50值（最大抑制浓度的一半）为9.92μM，仅略低于正常氧气条件下的IC50（21%O2条件下IC50=7.88μM，图4C）。随后，活细胞/死细胞染色更直观地证实了Rd-TTPA在缺氧条件下对4T1细胞具有良好的杀伤作用（图4F）。为了研究Rd-TTPA在缺氧条件下是否能有效激活焦亡，通过LSCM观察了细胞的形态变化。在超声照射下与Rd-TTPA一起孵育的缺氧4T1细胞表现出明显的细胞形态变化，包括细胞膜溶解和焦亡体形成（图4E），这与常氧条件下的焦亡特征相似（图4A）。因此，研究者得出结论，即使在缺氧环境中，Rd-TTPA也能诱导焦亡，这可能是由于基于SDT的O2-•发生器和焦亡诱导剂Rd-TTPA在超声波照射下通过一种不依赖O2的治疗途径产生O2-•。Rd-TTPA的这种独特特性使其成为治疗深部和缺氧性肿瘤的有价值的治疗方法。

图5. Rd-TTPA的体内抗肿瘤作用

鉴于Rd-TTPA在体外具有出色的NIR-II荧光发射，使用NIR-II体内图像系统研究了Rd-TTPA的肿瘤积累和体内成像能力。首先，在肿瘤内注射Rd-TTPA 0-48小时后，小鼠肿瘤中1000 nm长通（LP）通道的荧光几乎没有明显变化（图5C），表明其具有优异的NIR-II成像能力和Rd-TTPA在肿瘤中的长保留时间。静脉注射Rd-TTPA后，肿瘤部位的NIR-II荧光亮度随时间增加，在8小时达到最大强度，96小时的荧光信号仍然明亮。活体结果表明，Rd TTPA可以靶向并集中在肿瘤中，并且具有较长的肿瘤保留时间（约96小时），这有利于肿瘤的特异性NIR-II荧光成像和活体小鼠的成像引导SDT。

鉴于其在细胞和体内的优异性能，研究者通过焦亡增强SDT进一步证明了Rd-TTPA对4T1荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。首先，通过将4T1细胞皮下注射到雌性BALB/c小鼠的右后肢建立4T1肿瘤携带模型（图5A）。然后，用不同的治疗方法治疗荷瘤小鼠：（i）PBS，（ii）Rd-TTPA，（iii）US和（iv）Rd-TTPA+US，每2天一次，并监测和记录肿瘤体积14天。Rd-TTPA+US组的皮下肿瘤在14天的SDT治疗后没有明显生长，而其他组的肿瘤体积在视觉上有所增大，这表明Rd-TTPA可以通过SDT有效抑制肿瘤生长（图5B和D）。同时，各组荷瘤小鼠在不同治疗14天后体重没有显著变化，表明Rd-TTPA不影响小鼠的存活和生长（图5F）。随后，通过组织学研究证实了Rd-TTPA的抗肿瘤作用。肿瘤组织切片的苏木精和伊红（H&E）染色表明，对照组和另外两组（仅Rd TTPA和仅US）的细胞形态正常，而Rd-TTPA+US组的肿瘤细胞明显被破坏，表明基于Rd-TTPA的SDT具有出色的抗肿瘤效力，Ki-67染色进一步证实了这一点（图5G）。与对照组相比，Rd-TTPA+US组肿瘤组织中胱天蛋白酶-1和GSDMD-N的表达含量显著上调，表明SDT治疗肿瘤时发生了焦亡（图5E）。

总之，研究者创建了一种具有NIR-II发射的小分子焦亡生物调谐器Rd-TTPA，以在NIR-II荧光成像的指导下实现焦亡增强声动力肿瘤治疗。A-π-D1-D2型结构增强了供体-受体相互作用，有利于Rd-TTPA的分子内电荷转移和三重态形成，促进了其声动力学和NIR-II荧光性能。在超声波照射下，Rd-TTPA通过大量O2-•的产生诱导肿瘤细胞焦亡。Western Blot研究进一步揭示，Rd-TTPA介导的焦亡机制涉及Caspase-1/GSDMD通路。即使在缺氧条件下（2%O2），Rd-TTPA也能诱导焦亡并有效消融肿瘤细胞，表明SDT介导的焦亡是低O2依赖性的。体内肿瘤治疗揭示了Rd TTPA通过焦亡增强SDT和ICD的优异抗肿瘤作用。因此，本研究为设计一种声动力学生物调谐器提供了一种有前景的策略，用于通过NIR-II成像引导的SDT激活实体瘤的焦亡，并将推动新型声敏化剂在肿瘤治疗中的开发和应用。

参考文献

Wang X, Chi W, Wu J, et al. A NIR-II emissive sonosensitized biotuner for pyroptosis-enhanced sonodynamic therapy of hypoxic tumors[J]. Biomaterials, 2025, 315: 122969.
 

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