本文要点：开发小分子染料聚集的纳米光敏剂（nanoPS）用于协同光疗，是精准医学中引人注目的前沿研究。但目前，对分子结构、组装行为和治疗功能之间相互作用的研究有限。在这里，引入了“晶体聚集体中的自旋轨道电荷转移系间跃迁（SOCT-ISC）”的概念，能够显著增强小分子nanoPS的光动力（PD）和光热（PT）特性。具体而言，在含有三氰基呋喃（TCF）阴离子七甲川青（TCF-Cy7-TCF）染料的中位位置引入了一个阳离子吡啶（Py）基团，以构建一个正交电荷转移二联体（TCF-Cy7(Py)-TCF），通过SOCT-ISC机制增强三重态的形成以增强PD特性。双性离子基团赋予TCF-Cy7(Py)-TCF即使在超低浓度下也具有高结晶度，决定了其在聚集体中的堆积行为，并增强了PT和PD特性。与TCF-Cy7-TCF相比，TCF-Cy7(Py)-TCF纳米聚集体表现出更高的单线态氧量子产率（0.8% vs 0.2%）和光热转换效率（55.06% vs 7.78%）。令人印象深刻的是，TCF-Cy7(Py)-TCF优先积聚在肿瘤部位，在NIR-I和NIR-II窗口中实现了高信噪比的肿瘤成像，并且非特异性结合极少。最终，体内实验证实TCF-Cy7(Py)-TCF纳米聚集体作为协同光疗的nanoPS功能，为设计单组分PS用于临床转化提供了一种简单而有效的策略。

研究者提出了一种利用“晶体纳米聚集体中的SOCT-ISC”的方法，将SOCT-ISC的优势与PS的超分子组装结合到一个统一的纳米平台中。在本研究中，通过将吡啶阳离子（Py）引入到对称阴离子Cy7（TCF-Cy7-TCF）的中位位置构建了一个双性离子二联体（TCF-Cy7(Py)-TCF）。这个二联体可以在水溶液中以极低的浓度自组装成纳米聚集体，而不需要稳定剂和赋形剂（图1）。通过这种设计，由于PS的正交几何结构的自组装限制了辐射衰减，TCF-Cy7(Py)-TCF的光热转换效率和ROS生成显著优于市售的ICG以及类似的TCF-Cy7-TCF。值得注意的是，TCF-Cy7(Py)-TCF在聚集体中松散堆积，这可以优化非辐射衰减，并有助于增强PTT和PDT性能。具有双性离子性质的TCF-Cy7(Py)-TCF纳米聚集体通过增强了的渗透和滞留（EPR）效应表现出超低的非特异性组织摄取和高肿瘤积累。使用皮下肿瘤小鼠模型证实，TCF-Cy7(Py)-TCF纳米聚集体不仅提供精确的光声（PA）和近红外（NIR）荧光成像，还通过“晶体纳米聚集体中的SOCT-ISC”机制表现出PTT/PDT协同效应，为设计先进的光治疗剂提供了新的分子指导。

图2. TCF-Cy7（Py）-TCF及其母体分子TCF-Cy7-TCF的光物理性质。

TCF-Cy7(Py)-TCF二联体的稳态紫外-可见-近红外（UV-Vis-NIR）吸收光谱进行了研究（图2）。在有机溶剂如甲醇（MeOH）中，TCF-Cy7(Py)-TCF二联体的吸收（图2a,b）和荧光（图2c）光谱与相关的TCF-Cy7-TCF染料非常相似。具体而言，TCF-Cy7(Py)-TCF二联体在甲醇中的吸收光谱在904 nm处显示出一个强烈的峰值，相比于TCF-Cy7-TCF（888 nm）发生了红移（图2b）。此外，TCF-Cy7(Py)-TCF二联体的荧光光谱也相应地红移（图2c），但其Stokes位移保持不变。对于TCF-Cy7-TCF和TCF-Cy7(Py)-TCF二联体的主要发色团，获得了类似的ESP分布，负区域出现在两侧的TCF基团中，而正区域集中在Cy7的多亚甲基桥中，表明它们具有高度对称的电子结构（图2d）。值得注意的是，TCF-Cy7(Py)-TCF二联体的Py基团上出现了一个极度正的区域，表明Py基团具有强烈的电子吸引特性（图2d）。为了进一步可视化电荷转移动力学，进行了飞秒瞬态吸收（fs-TA）测量（图2f，g）。在780 nm的脉冲激光激发下，水中的TCF-Cy7-TCF和TCF-Cy7(Py)-TCF二联体均在其最大吸收处显示出明显的负吸收带，这被归因于基态漂白（GSB）。对于TCF-Cy7-TCF（40 µm），在≈570 nm处观察到激发态吸收（ESA）带（图2f），这归因于1TCF-Cy7-TCF态，其完全衰减时间仅为≈96 ps（图2h）。相比之下，TCF-Cy7(Py)-TCF二联体（40 µm）在1.11 ps内在≈600 nm处呈现出一个特别显著的峰值，这可以归因于CTS（TCF-Cy7-TCF–Py+−，图2g）。其衰减动力学在纳秒时间尺度上（>3 ns）未显示出完全恢复，这表明具有慢电荷重组的长寿命CTS可以优先松弛到激发的T1态（图2h）。

图3. TCF-Cy7（Py）-TCF 在水溶液中的自组装和光疗性能

使用动态光散射（DLS）对水中的明显聚集体进行表征，发现TCF-Cy7-TCF仅表现出有限的聚集，未形成纳米聚集体。相比之下，TCF-Cy7(Py)-TCF形成了平均水动力直径约为155 nm的纳米聚集体。这样的纳米聚集体非常稳定，在水或补充血清的细胞培养基中孵育24小时后不会沉淀或形成大块（图3a）。透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）图像显示TCF-Cy7(Py)-TCF纳米聚集体的形态为规则的球形纳米粒子，平均大小约为140 nm（图3b）。使用高倍TEM进一步研究了纳米粒子中TCF-Cy7(Py)-TCF分子的堆积模式，显示存在一些小的超分子晶体域（图3c）。TCF-Cy7(Py)-TCF纳米粒子的粉末X射线衍射图谱显示了与其单晶相似的图谱，表明TCF-Cy7(Py)-TCF分子的排列方式类似于其单晶中的排列（图3d）。此外，原子力显微镜（AFM）显示纳米粒子具有清晰的圆形边缘，其厚度/直径比远小于1，表明其结构类似于二维结构的纳米碟（图3e）。值得注意的是，TCF-Cy7(Py)-TCF能够在低至35 nm的浓度下形成这样的纳米碟，这种超低临界胶束浓度（CMC）表明纳米碟在临床相关浓度下可能比商业胶束更稳定。

接着研究了TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟在激光照射下产生高热或ROS的能力。在近红外（NIR）照射下（808 nm, 1.0 W cm−2）10分钟，TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟的溶液温度分别在10、20和40 µm的浓度下增加到47.6、54.0和59.5 °C（图3f）。TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟的光热转换效率（η）值为55.06%，显著高于TCF-Cy7-TCF（7.78%）（图3g）。TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟的产热能力在连续五次辐照-冷却循环后保持一致（图3h），表明其光热稳定性优于TCF-Cy7-TCF。如图3i所示，DPBF在NIR照射（808 nm，0.3 W cm−2）下迅速降低吸收，表明TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟产生了ROS，而单独的DPBF在相同照射5分钟内保持稳定（图3j）。然后确定DPBF的分解速率常数（图3k），计算出TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟在水中的Φ∆为0.8%，是ICG的四倍。同时，在水中具有有限聚集但缺乏正交Py的TCF-Cy7-TCF的Φ∆测量值为0.21%，略高于相同条件下的ICG。使用 “聚集体中的SOCT-ISC”机制，该机制将SOCT-ISC的益处与PS的超分子组装集成到一个平台中，实现高效的PTT/PDT。

图4a中的黄色荧光表明TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟与溶酶体的共定位，得到的Pearson相关系数（Rr）约为92%。相比之下，4T1细胞中TCF-Cy7-TCF和LysoTracker Green的Rr仅为73%，表明TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟和TCF-Cy7-TCF通过不同的途径被细胞内化。这些发现进一步表明TCF-Cy7-TCF表现出有限的聚集，并且不形成大尺寸的纳米粒子。

通过商业试剂确定细胞中由照射介导的ROS生成。在近红外（NIR）照射（808 nm, 0.3 W cm−2）下，使用TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟处理的4T1细胞产生强烈的细胞内绿色荧光，这种荧光增强被ROS清除剂维生素C（Vc）显著抑制。相比之下，在用TCF-Cy7-TCF或PBS处理的对照组中，无论是否激光照射，均未检测到明显的荧光信号（图4b）。结果表明，TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟在NIR照射下具有在细胞中生成ROS的强大能力，使其非常适合用于PDT。

为了验证增强的PDT和PTT的协同效应，使用等浓度的TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟或TCF-Cy7-TCF（12.5 µm）处理4T1细胞，进行LIVE/DEAD染色试验。结果显示，TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟在单模式（单一PTT或PDT）和协同光疗（图4c）中均表现出优于TCF-Cy7-TCF的效果，同时具有良好的生物相容性（图4d）。随后，计算了在NIR照射下细胞的半数最大抑制浓度（IC50），得出了TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟在单一PDT、单一PTT和PDT与PTT结合中的IC50值分别为16.8、5.6和5.0 µM（图4d）。相比之下，在4T1细胞中，TCF-Cy7-TCF在单一PTT和PDT/PTT结合中的IC50值分别为29.6和25.4 µM。这些结果表明，TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟介导的PTT和PDT结合作为一种有前途的策略，可以在空间和时间可控的方式中，以高生物安全性有效消除癌细胞。

在牛血清白蛋白（BSA）溶液中使用TCF-Cy7(Py)-TCF纳米碟的吸收和荧光光谱评估TCF-Cy7(Py)-TCF的非特异性结合，阴离子TCF-Cy7-TCF作为对照（图5a，b）。在含有BSA的水溶液中，TCF-Cy7-TCF恢复了其在有机溶剂中的特征吸收，并在≈950 nm处显示出强烈的荧光，表明TCF-Cy7-TCF通过与BSA结合从寡聚体转变为单体。相比之下，TCF-Cy7(Py)-TCF在BSA溶液中的吸收和荧光光谱未显示显著变化，这表明它与BSA没有显著的相互作用。进一步进行分子对接研究，通过使用优化构象评估TCF-Cy7-TCF和TCF-Cy7(Py)-TCF与BSA的相互作用。TCF-Cy7-TCF与BSA的结合能为−9.86 kcal mol−1，而TCF-Cy7(Py)-TCF与BSA的结合能仅为−5.81 kcal mol−1，表明由于其双性离子和亲水性性质，TCF-Cy7(Py)-TCF与BSA结合口袋的结合要比阴离子TCF-Cy7-TCF弱得多（图5c）。

由TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒或TCF-Cy7-TCF的光热转换引起的热弹性膨胀产生了光声（PA）信号，该信号被用作非侵入性PA成像的造影剂。如图5d，e所示，肿瘤部位TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒的PA信号在1-8小时内迅速增加，并且显着高于肿瘤中TCF-Cy7-TCF的PA信号，这可能是由于TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒的光-热转换较高。应该强调的是，用TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒处理的小鼠的初始PA背景远低于TCF-Cy7-TCF，并且在24小时后几乎可以忽略不计，这可能是由于快速清除和低非特异性摄取TCF-Cy7（Py）-TCF。相反，TCF-Cy7-TCF在同一时间过程中几乎没有背景降低，表明在正常组织和器官中有显着的非特异性摄取（图5d）。

之后研究者测量了TCF-Cy7（Py）-TCF纳米AUCER或TCF-Cy7-TCF在小鼠4T1肿瘤模型中的体内性能。注射后8小时，小鼠接受剖腹手术，仅在肿瘤（信号背景比，SBR:2.57±0.56）和肠道（SBR:1.65±0.56）中观察到NIR窗口I（NIR-I，700-900 nm）中TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒的荧光，而TCF-Cy7-TCF主要在肝脏（SBR:2.47±0.10）和肠道（SBR:5.02±0.26）等代谢器官中表现出高NIR-I信号，证实TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒可以钝化Ely通过EPR效应在肿瘤部位累积（图5f）。值得注意的是，在含白蛋白的环境中，TCF-Cy7-TCF的荧光峰红移至943 nm，而TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒的最大发射保持在980 nm（图5b），两者均显示第二个NIR窗口（NIR-II，1000-1700 nm）的尾部荧光，由于穿透深度更深，分辨率更高，自发荧光为零，可用于避免剖腹手术和开胸手术。注射后6-8小时，通过用NIR-II PL体内成像系统（系列III 900/1700）绘制NIR-II荧光强度图，TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒的信号在肿瘤（SBR:7.95±0.11）和肝脏（SBR:6.08±1.56）中积累，对比度良好（图5g）。为了比较，系统地观察到TCF-Cy7-TCF的NIR-II信号，在没有肿瘤靶向的正常组织和器官中显示出显着的非特异性摄取。剖腹手术后的影像学结果非常相似（图5g）。总体而言，两性离子TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒通过电荷/疏水性屏蔽最小化了与血清白蛋白的相互作用，并在肿瘤部位累积，减少了正常组织和器官中的非特异性摄取，从而产生足够高的肿瘤背景比成像。

在多模式成像的指导下，研究者使用TCF-Cy7-TCF作为对照，进一步评估了TCF-Cy7（Py）-TCF纳米微粒对携带4T1癌症的皮下肿瘤异种移植小鼠的光疗功效。将35只小鼠随机分为7组，用红外热成像监测肿瘤表面的实时温度（图6a）。照射后10分钟内，“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”组小鼠的肿瘤表面温度超过50°C，而“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.15 W cm-2”，“TCF-Cy7-TCF+0.5 W cm-2”和“盐水+0.5 W cm-2”组小鼠的肿瘤表面温度仅分别增加至41、42和34°C（图6b）。每组肿瘤大小每2天监测一次，持续16天（图6c，d）。对照组小鼠的肿瘤大小持续增加，与第1天相比，在第16天经历了约13倍的扩张，这些组之间的肿瘤体积没有显着差异（图6d）。“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”组小鼠的肿瘤被有效消融，导致肿瘤部位出现烧伤疤痕，这在对照组中未观察到（图6c）。到第11天，用TCF-Cy7（Py）-TCF进行协同光疗的小鼠的瘢痕已经愈合，并且在很长一段时间内没有观察到肿瘤复发，直到安乐死之前也没有任何死亡率。通过苏木精和曙红（H＆E）以及不同组肿瘤的TUNEL染色也证实了体内肿瘤光疗的效果。H＆E染色清楚地显示“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”组中的肿瘤具有大量坏死区域，TUNEL染色显示细胞凋亡在肿瘤中最有效“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”组（图6e）。

总之，本文提出了“聚集体中的SOCT-ISC”的概念，以增强基于小分子的PS的PDT和PTT性能，旨在协同光疗肿瘤。基于这一概念，通过在阴离子TCF-Cy7-TCF的中间位置掺入阳离子Py基团来设计小分子PS，从而形成正交的二元TCF-Cy7（Py）-TCF。这种二元自组装成纳米聚集体，与母体分子TCF-Cy7-TCF相比，ROS产生（0.8%）和光热转换效率（55.06%）显着增强。值得注意的是，TCF-Cy7（Py）-TCF的两性离子性质赋予纳米聚集体以优异的稳定性，即使在超低浓度下也是如此，并且赋予它们低的非特异性结合，导致正常组织和器官中的摄取最小，并且肿瘤中的高积累用于多模式成像。最后，TCF-Cy7（Py）-TCF纳米聚集体在体外和体内均具有优异的抗肿瘤功效，并具有高生物相容性。这种独特的超分子策略可能为设计用于抗肿瘤治疗中协同PTT/PDT的高性能小分子PS提供有价值的见解，显示出未来临床实施的巨大潜力。

参考文献
Hao X, Gao M, Zhang R, et al. Synergistic Phototherapy Using Zwitterionic Crystalline Nanoaggregates of Orthogonal Donor–Acceptor Small‐Molecule Dyads[J]. Advanced Functional Materials, 2024: 2416317.

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