FLIM利用荧光寿命这一参数，该参数用于衡量荧光分子或荧光染料在激发态平均停留的时间，随后通过发射荧光光子返回基态。荧光染料在激发后并非总是在精确的时间发射光子，而是呈现出一个时间分布，该分布可用指数衰减函数描述。该衰减过程的特征时间常数即为荧光寿命，其范围通常在几个皮秒（1–10 ps）至数十纳秒（10–100 ns）之间。

荧光寿命作为纳米环境的探针

荧光寿命是每种荧光染料或分子的特征参数，可能随其纳米级周围环境或构象状态而变化。寿命信息可探测分子所处环境的组成特性，例如离子浓度、pH值、脂溶性或与其他分子的结合情况。

寿命测量与成像相结合

LIM将寿命测量与成像相结合：对像素级获得的寿命值进行颜色编码，从而生成图像。因此，FLIM不仅能提供荧光分子的空间分布信息，还能同时反映其纳米环境的相关特性，从而带来额外维度的信息。

FLIM数据采集和分析原理

1. 重复测量激光激发荧光团和荧光光子到达检测器每个像素之间的时间（参见图1A）。
2. 计算激光脉冲后光子计数与到达时间的直方图。
3. 对每个直方图拟合指数衰减曲线F(t)=A0 exp (-t/τ)，其中振幅F(t)反映特定时间点检测到的光子总数，时间常数τ称为荧光寿命（参见图1B）。
4. 生命周期图像使用任意颜色显示每个生命周期值（参见图1C）。

图1：A）示意图显示对荧光光子到达时间的重复测量，即激光激发与光子发射检测之间的时间间隔。B）激光脉冲后光子到达时间的光子计数直方图。对直方图拟合指数衰减曲线，其中振幅反映总光子数，时间常数τ为荧光寿命。C）一个非常简单的荧光寿命图像示例，演示如何使用任意颜色查找表对不同寿命值（τ1、τ2等）进行显示。

FLIM解决方案

利用STELLARIS 8 FALCON系统的FLIM功能。有效研究细胞生理学并探索活细胞的动态变化。


U2OS细胞经α-tubulin（AF546）和vimentin（AF555）免疫染色后的强度与FLIM图像[1]。比例尺为5µm，颜色条范围为0–3ns。

资料来源
L.Alvarez, B. Widzgowski, B. van den Broek, G. Ossato, K. Jalink, L. Kuschel, J. Roberti, F. Hecht： 实现视频速率共焦FLIM的荧光寿命成像新概念 ：使用SP8 FALCON，科学实验室（2019年）徕卡微系统公司。

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