关键词：重组人PD-1，IgV结构域，配体结合

[导语] 重组人pd-1蛋白在目录里挂在药物靶点一栏，名字读起来像一整条受体，实际只包含胞外那一段。它把一个刹车分子的识别面单独拿出来，做结合实验时变量少了一半。想把它用明白，先看清这块 IgV 结构域长什么样。

一、重组人pd-1蛋白对应的 PD-1，在免疫反应里管哪一步？

PD-1 又叫 CD279，由 PDCD1 编码，是一条 I 型跨膜蛋白，全长 268 个氨基酸。它属于诱导型表达，静息 T 细胞表面含量很低，活化之后才逐步上调，调节性 T 细胞与耗竭型 T 细胞上则长期偏高。

从分子机制层面分析，它的工作方式不是自己发信号，而是在受体附近布置一道抑制。配体结合之后，胞内段的酪氨酸基序被磷酸化，磷酸酶被招募过来，把邻近受体上的磷酸基团水解掉。抑制从这一步开始，往下游传递。

二、为什么一个 IgV 结构域就能认出两条配体？

PD-1 的胞外部分只有一个免疫球蛋白可变区样的结构域，没有第二个结构域帮忙。结合面集中在顶端的几个环上，构象相对平坦，能同时容纳 PD-L1 与 PD-L2 这两条 B7 家族配体。

两条配体在结构上相近，共用同一个识别区域并不矛盾。差别在表达分布：PD-L1 覆盖面宽，肿瘤细胞与多种免疫细胞都能表达；PD-L2 主要在树突状细胞与巨噬细胞上。做阻断实验时，选哪条配体取决于你要模拟的是哪一种细胞环境。

值得注意的是，PD-L2 与 PD-1 的结合强于 PD-L1，而 PD-L1 还能与 CD80 结合。这两点解释了同一支抗体在不同配体上的表观活性为什么会差出一截。

三、胞内那两个酪氨酸基序，把信号按在哪一步？

胞内段有两段特征序列，一段是免疫受体酪氨酸抑制基序，一段是免疫受体酪氨酸转换基序。磷酸化之后，它们成为磷酸酶 SHP-2 的停靠点，把可溶的酶拉到膜附近。

SHP-2 到位后做的事很直接：把 CD28 胞内段的磷酸化位点水解掉。共刺激信号起不来，PI3K 与 Akt 通路跟着熄火，葡萄糖摄取下降，IL-2 的转录也启动不了。

同一套机制还作用在 TCR 近端，ZAP70 与 CD3ζ 的磷酸化水平一起下降。抑制点不止一个，读出时选哪一层，决定你看到的是结合还是功能。

四、可溶的胞外域和膜上的受体，差在哪？

这支重组蛋白只包含 Leu25–Gln167 这一段，也就是信号肽之后的胞外区，C 端接了一段 His 标签。它既没有跨膜区，也没有胞内段。

可溶形式在溶液里以单体为主，膜上的 PD-1 在配体结合后可以聚集。做固相结合实验时，包被在板上的蛋白相当于把受体固定住，能部分模拟这种聚集，但与细胞膜上的真实排布仍有距离。

所以结合曲线能回答配体还认不认、抗体表位还在不在，回答不了信号能不能往下传。功能层面的问题，要交给细胞实验。

五、还原胶上那条 28–36 kDa 的宽带是怎么来的？

按 143 个氨基酸推算，蛋白骨架不到 16 kDa，跑出来却落在 28–36 kDa 区间，而且是一片弥散带。原因在糖链：PD-1 胞外域带多个 N-糖基化位点，糖链长度不均一，迁移位置自然散开。

看到宽带先不必怀疑降解。更该留意的是条带整体下移，或者高分子量区出现拖尾，那说明折叠或修饰出了问题，此时结合曲线往往也跟着走形。

官网给的电泳图是 1 μg 上样、还原与非还原两个条件并排。非还原条件下条带略高，与分子内二硫键维持的紧凑构象有关。

六、构建区间 Leu25–Gln167 说明了什么？

起始位置落在信号肽之后，说明这支蛋白从成熟蛋白的 N 端开始，没有带分泌引导序列；终止位置在胞外区末端，跨膜段之前。区间完整，配体结合面才完整。

若构建截短到只保留部分环区，结合活性可能还在，但构象依赖的抗体表位会丢，做抗体筛选时容易出现假阴性。

标签接在 C 端，方向朝外，一般不干扰顶端的配体结合面。用抗 His 抗体做检测时，识别的是与配体相反的一侧，两条路径可以同时走。

七、种属与表达系统怎么影响使用？

这支蛋白是人源序列、HEK293 表达。人源细胞株的折叠与糖基化更接近天然受体，做构象依赖的结合实验时偏差小一些。

种属错配是常被跳过的一步。人的 PD-1 与小鼠 PD-L1 结合能力有限，把人的蛋白加到小鼠细胞体系里，常常读不出反应，容易被误判成蛋白失活。做小鼠实验，就选小鼠来源的蛋白与细胞。

内毒素控制在 0.1 EU/μg 以下，对应的是原代 T 细胞与 PBMC 体系。内毒素偏高时细胞先被激活，读出的细胞因子变化分不清来自 PD-1 还是来自污染。

八、结语

把 PD-1 看成一块只有识别面的受体片段，很多细节就顺了：为什么只有一个结构域却能认两条配体，为什么还原胶上是一片宽带，为什么结合做得漂亮、细胞实验却没有反应。

九、重组人pd-1蛋白的产品数据与质控：一张胶加三条曲线

重组人pd-1蛋白的官网数据给了一张还原胶与三条结合曲线。胶回答这一批是否完整、修饰是否正常，曲线回答两个识别面是否都还在——配体一侧与抗体一侧。两份数据放在一起看，才谈得上这一批能不能直接用。

图3 SDS-PAGE：M 为分子量标记（15–130 kDa），NR 为非还原、R 为还原条件，两条泳道在 28–36 kDa 处呈一片弥散带，上样量 1 μg（数据来自官网产品页）

图4 结合曲线：横轴为人 PD-L1 Fc 嵌合蛋白浓度（μg/mL，对数刻度），纵轴为 450 nm 平均吸光度，曲线在 −2 与 0 之间快速抬升后进入平台（数据来自官网产品页）

种属与表达系统 Human，HEK293 表达
标签与构建区间 C 端 His；Leu25–Gln167
分子量 28–36 kDa（还原条件）
纯度 ＞95%（还原条件 SDS-PAGE）
内毒素 ＜0.1 EU/μg
活性 包被 1.5 μg/mL 时与 PD-L1 Fc 嵌合蛋白结合，EC50 0.141–0.174 μg/mL；包被 0.5 μg/mL 时与 Nivolumab、Pembrolizumab 结合，EC50 分别为 2.24–2.98 ng/mL 与 1.28–1.49 ng/mL
亲和力（官网补充） SPR 测 PD-L1 Fc 为 0.6644 μM；BLI 测为 1.6 μM
缓冲体系与复溶 PBS、5% 海藻糖、pH7.4；冻干粉，快速离心后用超纯水复溶至 0.1–1 mg/mL
保存条件 冻干粉 −20 至 −80℃ 12 个月；复溶后 −20 至 −80℃ 3 个月，或 2–8℃ 1 周
产品推荐：PD-1 His Tag Protein, Human（UA010004）

优爱（UA BIOSCIENCE）提供人 PD-1 胞外域重组蛋白，HEK293 表达、C 端 His 标签，构建区间 Leu25–Gln167，纯度＞95%（还原条件 SDS-PAGE），内毒素＜0.1 EU/μg，可用于 PD-L1 与 PD-L2 结合研究、检查点抗体结合活性测定与包被抗原制备。