一氧化氮（NO）是一种多功能的内源性信号分子，参与多种生理过程。在炎症过程中，活化的巨噬细胞会产生大量NO，其作为促炎效应物参与慢性炎症疾病和自身免疫性疾病的发生发展。开发能够使蛋白质对NO产生响应的激活策略，将为研究NO信号传导提供有力工具。近期北京大学药学院刘涛教授团队在Nature Biomedical Engineering(IF 26.3)上发表文章“Engineering inflammation-responsive proteins through nitric oxide-caged amino acids”，研究开发了一套蛋白质工程策略，能够在富含NO的环境中特异性恢复蛋白质功能，在炎症靶向治疗、基因递送和生物传感领域具备潜在应用价值。

· 维真助力 - AAV产品 ·

In vivo

病毒产品：NO-AAV-DJ-FLUC-EGFP、AAV-DJ-FLUC-EGFP

实验动物：6～8周龄雌性BALB/c小鼠

注射方式：尾静脉注射

注射量：2×10¹⁰ particles

In vivro

病毒产品：NO-AAV2-EGFP、AAV2-EGFP；NO-AAV9-EGFP、AAV9-EGFP

感染细胞：HEK293T细胞

结果展示

1、应用NOCAGE触发病毒基因转导

作者开发了一种基于NO的蛋白质激活策略，将其命名为NOCAGE，并通过这种方法设计了能够响应NO的抗体、酶、细胞因子、细菌毒素和病毒衣壳的变体。腺相关病毒载体是基因递送的重要工具，作者靶向AAV2衣壳蛋白上的保守E563位点（对于病毒转导至关重要），将E563替换为NorE，构建了NO触发基因转导的腺相关病毒（NO-AAV2），并制备了编码EGFP报告基因的NO-AAV2。通过显微镜和流式细胞术分析NO-AAV2感染的人胚胎肾HEK293T细胞，发现EGFP表达水平极低，证明NorE在E563位点的引入有效抑制了病毒基因转导。但在200μM PAPA NONOate处理下，NO-AAV2恢复了其转导效率，达到AAV2-WT活性约90%。鉴于E563残基在多种AAV血清型中的高度保守性，作者在AAV9相应位点引入NorE，成功实现了NO触发的AAV9转导。这些结果表明，NOCAGE技术能够使AAV病毒基因转导实现NO触发。

图1 NOCAGE能在多种蛋白中实现NO响应性激活

2、应用NO响应性腺相关病毒进行炎症肝脏特异性基因递送

作者随后开发了可在肝脏炎症模型中实现NO触发基因转导的NO-AAV-DJ，包装FLUC荧光素酶报告基因，体外感染HEK293T细胞。发光测定结果显示NO依赖性的FLUC表达，证实了NO-AAV-DJ的NO触发基因转导。随后研究者在肝炎模型小鼠体内评估NO-AAV-DJ的体内递送效果：注射野生型 AAV-DJ的对照组小鼠，肝脏呈现强烈生物发光，同时伴随明显的非靶组织信号；注射NO-AAV-DJ的肝炎模型小鼠，肝脏可检测到强烈的荧光素酶信号，在肌肉等非靶组织几乎检测不到FLUC表达，脱靶表达显著降低；而无炎症的健康小鼠体内几乎检测不到荧光素酶信号，说明NO-AAV-DJ在缺乏NO的正常组织中处于失活状态。为进一步评估慢性炎症条件下NOCAGE的响应性，作者建立了CCl4诱导的肝纤维化模型，发现给予NO-Rluc后产生了强大且肝特异的生物发光信号，证实了纤维化肝脏中NO的产生增加。长期监测和免疫原性评估表明，NO-AAV-DJ保持了稳定的FLUC表达，并表现出与AAV-DJ-WT相当的免疫原性。这些结果表明，NO-AAV-DJ能够实现NO触发的炎症肝特异基因转导，且脱靶表达水平低，具备良好的转化潜力。

图2 NO响应性AAV能特异性地将基因转导至炎症肝脏

实验结论

本研究开发了一种基于NO的蛋白质激活策略NOCAGE，用于改造原本不具备NO响应能力的蛋白质，从而能够在发炎的组织中实现精确、局部的激活。该方法适用于多种蛋白质，在炎症靶向治疗、基因递送和生物传感领域具有潜在应用价值，凸显了其在基础研究和转化医学领域广泛应用的潜力。