在细胞中，蛋白质的合成并非一成不变：外界刺激、发育信号或疾病状态都会动态调控特定蛋白的“出生时间”与“出生地点”。传统方法——如放射性氨基酸脉冲标记或质谱分析——能回答“合成了多少”，却难以回答“在哪里合成”以及“新生蛋白随后去了哪里”。

2015年发表在Nature Methods 上的《Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ》，开发了一种将代谢标记与邻位连接技术（PLA） 相结合的策略，成功实现了对特定内源性新生蛋白的原位可视化，分辨率达到亚细胞级别。主要包括两种平行方案：FUNCAT‑PLA（基于非天然氨基酸AHA）和Puro‑PLA（基于嘌呤霉素）。

一，工作原理

FUNCAT：用AHA（叠氮高丙氨酸）替代甲硫氨酸，掺入新生蛋白；再通过点击化学为其接上生物素。

Puro：用低浓度嘌呤霉素处理细胞，嘌呤霉素作为tRNA类似物会终止翻译并留在新生肽链C端。

图1、新生蛋白标记工作原理

特异性识别目标蛋白：同时使用目标蛋白（POI）的特异性抗体。

PLA原位检测：只有当“新生标签抗体”与“POI抗体”在空间上足够接近（<40 nm），PLA探针才会连接成环并启动滚环扩增，最终产生明亮的荧光点。反之则无信号，背景极低。

二，方法验证：信号依赖性与特异性

FUNCAT-PLA（Fig. 1b）：左图显示 AHA 标记 2 小时后，新生 Camk2a 信号在神经元胞体和树突中清晰可见；右图中省略抗 Camk2a 抗体，信号完全消失。

Puro-PLA（Fig. 1c）：左图显示嘌呤霉素标记 15 分钟后，新生 Camk2a 信号清晰；右图中用蛋白质合成抑制剂 anisomycin 预处理，信号几乎完全消失。

这些对照实验结果证明，所检测到的 PLA 信号确实来自新合成的目标蛋白。

图1、（b）新合成 Camk2a（2 小时 AHA）在培养海马体神经元（左）和无抗 Camk2a 抗体对照组（右）中 FUNCAT-PLA 信号（绿色）的示例图像。（c） 新合成的 Camk2a（绿色）在未使用（左）或（右）蛋白合成抑制剂阿尼索霉素标记 15 分钟后，Puro-PLA 图像

三、不同蛋白的亚细胞分布

FUNCAT-PLA：AHA 标记 2 小时后，Bassoon（突触前蛋白）的信号不仅出现在胞体，还沿树突分布（可能位于相邻的突触前末梢）；而 TGN38（高尔基体/内体蛋白）和 Lamin B（核纤层蛋白）的信号则高度集中于胞体，树突中极少（Fig. 1d）。

Puro-PLA：嘌呤霉素标记 5 分钟后，TGN38 的信号同样集中在胞体，与 FUNCAT-PLA 结果一致（Fig. 1e）。

结果表明新合成蛋白的分布模式与其 mRNA 的亚细胞定位高度吻合：已知Camk2a mRNA 在树突中丰富，其新生蛋白也分布于树突；而 TGN38 和 Lamin B 的 mRNA 不在树突富集，其新生蛋白仅限于胞体。这证明两种方法均可用于推断蛋白是否在局部合成。

四、时间线性与灵敏度比较

FUNCAT-PLA：AHA 标记时间在 0.5–2 小时内，PLA 信号呈线性增加；Puro-PLA：嘌呤霉素处理时间在 2–15 分钟内，PLA 信号也呈线性增加。在相同的 15 分钟标记条件下，Puro-PLA 的信号强度比 FUNCAT-PLA 高约 10 倍（Fig. 1f）。

FUNCAT-PLA 需要较长的标记时间（小时级），适合 追踪蛋白的长期命运。而Puro-PLA 可在秒至分钟级 完成标记，具有更高的时间分辨率和灵敏度，适合 捕捉快速发生的合成事件。

图1、（d） 新合成Bassoon、TGN38 或 LaminB（如所示，2 小时 AHA）在培养海马神经元体质和主树突中（MAP2 轮廓以品红色）中，进行 FUNCAT-PLA（灰度）高倍图像。比例杆 = 10 微米。（e） 新合成的 TGN38 显微照片，进行 5 分钟的嘌呤霉素化。插入：如（d）所示的索玛信号转换。比例杆 = 20 微米。（f） TGN38 FUNCAT-PLA 与 Puro-PLA 信号（体体中 PLA 强度的整合）与 AHA 和普罗霉素对孵育时间依赖性的相关性。

五、证明局部合成：Puro-PLA 的 N/C 端比较（Fig. 2a–c）

嘌呤霉素会终止翻译，因此新生肽链的 N 端先合成，C 端可能尚未完成。若信号来自同一新生肽链，则 N 端抗体的 Puro-PLA 信号应强于 C 端抗体（Fig. 2a）。结果发现仅用 4 分钟 嘌呤霉素标记，即可在树突附近检测到新生 Bassoon 信号（Fig. 2b）。针对 Bassoon 蛋白，N 端抗体的 Puro-PLA 信号显著高于 C 端抗体（Fig. 2c）。

结果证明，Puro-PLA 信号主要来自两个抗体结合到同一条新生肽链上，而非相邻的两个不同蛋白。树突旁在极短标记时间内出现的信号，提供了 Bassoon 存在局部翻译的直接证据。

图2、评估 Puro-PLA 的分子内标记。a） 描绘 N 端和 C 端抗巴松管抗体结合位点的方案（b）代表性荧光图像和特写（上面板，PLA 信号绿色，MAP2 品红和 DAPI 标记核蓝，下板灰度 PLA 信号），显示在用嘌呤霉素标记四分钟或未使用嘌呤霉素后，使用 N 端或 C 端抗 Bassoon 抗体后检测到的 Bassoon 蛋白 Puro-PLA 信号。比例尺=30 um和 10 um。

六、蛋白周转与运输

先给细胞2小时AHA标记（脉冲），再换成普通培养基培养不同时间（追赶）进行半衰期测定。结果发现追赶24小时后，TrkB信号剩不到一半。追赶48小时后，Bassoon信号仍剩一半以上（Fig. 3b）。

Bassoon在追赶10分钟时主要在胞体；追赶24小时后，胞体信号减少，树突信号增加（Fig. 3c–d）。

结果表明FUNCAT-PLA 可原位评估蛋白质稳定性，所得半衰期（TrkB ~0.7 天，Bassoon ~2.6 天）与生化方法测定值一致。新合成的 Bassoon 从胞体向外运输，树突中早期出现较高信号提示快速运输或局部合成。

图3、(a) 示意图展示两种半衰期不同、经 FUNCAT‑PLA 标记的假想蛋白。(b) 经 2 小时 AHA 脉冲标记后，Bassoon 蛋白与 TrkB 蛋白的 FUNCAT-PLA 信号强度随追踪时间变化的曲线图。(c) 示意图展示经 FUNCAT‑PLA 标记的假想蛋白群体（绿色）的时空动态；下方为神经元胞体与树突（绿色 MAP2 轮廓）图像，显示 Bassoon 蛋白 FUNCAT‑PLA 信号（灰度图）。细胞经 2 小时 AHA 孵育后，分别进行10 分钟或24 小时追踪。比例尺 = 10 微米；树突长度 = 135 微米。(d) 图 (c) 的定量分析图。数值表示不同追踪时间下，各区域内最大信号密度的百分比。

七、活动依赖性新合成：GluA1 的 FUNCAT-PLA

用 TTX 或 TTX+APV 处理神经元诱导稳态可塑性，同时 AHA 标记 3 小时。结果显示，TTX 处理使 GluA1 新合成信号在胞体和树突中均增加，而 TTX+APV 处理增加更显著，且树突中的增幅大于胞体。结果说明稳态可塑性会上调 GluA1 的新合成，且树突中的局部合成可能参与了突触缩放（Fig. 3e–f）。

图3、(e) 显微图像显示：经 3 小时 AHA 标记后，对照组、单独阻断动作电位（TTX）、联合阻断动作电位与微小突触事件的 NMDA 成分（TTX/APV）（诱导稳态可塑性）条件下，GluA1 蛋白的 FUNCAT‑PLA 信号（上方：细胞全景；下方：对应树突局部）。GluA1 FUNCAT‑PLA 信号（绿色），MAP2（品红色）。比例尺：全景图 20 微米，局部放大图 10 微米。(f) 图 (e) 的定量分析。上图：神经元胞体中，GluA1 FUNCAT‑PLA 信号密度相对于对照组归一化；TTX/APV 处理显著上调 GluA1 新生蛋白水平（*P<0.05，P=0.0349）。下图：TTX 或 TTX/APV 处理均显著增强树突内 GluA1 新生蛋白量，且增强幅度高于胞体（*P<0.05，**P<0.01；数据为归一化均值 ± 标准误；3 次独立实验，每组 n=16–25 个细胞；采用单因素方差分析（ANOVA）及 Tukey 多重比较检验）。

八、方法总结

特性　FUNCAT PLA　Puro PLA
标记时间　小时级（≥2 h）　分钟级（2–15 min）
是否需要甲硫氨酸饥饿　是　否
信号强度　中等　高（约 10 倍）
能否长时程追赶　能（蛋白完整）　不能（嘌呤霉素截短蛋白，加速降解）
应用　半衰期测定、运输追踪、长时程命运　局部合成位点鉴定、快速合成检测

基于 Nature Methods 论文的实验结果，FUNCAT‑PLA 和 Puro-PLA 第一次让我们能够 在原位、以亚细胞分辨率观察内源性新生蛋白的“出生”与“一生”。两种方法各有优势，互为补充：

需要定位快速翻译事件或局部合成？ 选择 Puro‑PLA（时间分辨率高，灵敏度高）。

需要追踪蛋白运输、周转或长时程变化？ 选择 FUNCAT‑PLA（可进行脉冲‑追赶实验，不干扰蛋白功能）。

两种方法均已通过严格的对照验证，为神经科学、细胞生物学及疾病机制研究提供了前所未有的工具。

下一期小编将给大家带来两种方法的具体应用！

参考文献：tom Dieck, S. et al., Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods (2015).