邻位连接分析（Proximity Ligation Assay，PLA）把两种抗体之间的纳米级空间邻近关系，转化为显微镜下可计数的荧光或显色信号点。它兼顾了免疫检测的特异性与原位成像的空间信息，常用于验证蛋白互作、翻译后修饰以及蛋白与核酸的接近程度。下面按实验操作顺序梳理关键步骤。

一、样本封闭与一抗孵育
固定并通透后的细胞或组织切片先做封闭，降低非特异性吸附；随后加入两种一抗，分别识别目标蛋白，或同一蛋白上两个相邻表位。一抗的宿主物种与特异性直接决定背景水平，是整项实验中最需要预先验证的环节。

二、带寡核苷酸臂的二抗结合
加入分别偶联不同寡核苷酸臂的二抗（PLA 探针），使其与一抗结合。两组探针只有在空间上足够接近时，后续的连接反应才能发生，这正是 PLA 高特异性的来源。

三、连接成环与滚环扩增
加入连接酶与连接寡核苷酸，邻近的探针臂被连接成闭合 DNA 环；随后聚合酶以该环为模板进行滚环扩增，把单次识别事件放大为一条长的重复序列，从而显著提升信噪比。

四、探针杂交与信号判读
荧光或 HRP/AP 标记的探针与扩增产物杂交，加入底物后形成离散的点状信号。判读时以每个细胞核或每个细胞的信号点数量作为定量指标，并同步记录阳性细胞比例与信号面积占比。

五、对照与质控
建议至少设置三类对照：省略一抗的阴性对照、已知互作体系的阳性对照，以及使用抑制剂或敲低手段干预后的特异性对照。缺少对照时，PLA 的点状信号容易与抗体非特异性结合混淆。

方法特点与适用范围
PLA 的优势在于单细胞分辨率、可检测低丰度目标、能保留组织原位结构，并可用于蛋白互作与翻译后修饰的特异性检测。局限则包括依赖高质量抗体、通量有限、对样本固定条件敏感，因此更适合作为质谱或组学结果的正交验证手段，而非大规模筛选工具。

常见问题
问：PLA 信号点越多就一定代表互作越强吗？
不一定。信号数还受抗体亲和力、扩增效率与成像阈值影响，跨批次比较前需统一曝光参数并做归一化。
问：石蜡包埋（FFPE）组织能做 PLA 吗？
可以，但抗原修复条件需要单独优化，固定过度的样本常出现信号减弱。
问：PLA 与免疫荧光共定位有什么区别？
共定位受光学分辨率限制（约 200 nm 以上），PLA 只在两目标距离小于约 40 nm 时才产生信号，因此更接近「物理邻近」而非「图像重叠」。