导语：同样是"单细胞分辨率"，不同平台给出的数据并不是一回事。差别往往不在指标数，而在细胞边界是怎么定下来的。用核扩增画圆的平台，边界是"猜"出来的——密集区会重叠、异形细胞会套错；用膜蛋白标记把每个细胞框出来的平台，边界是"测"出来的。分割方式决定了每一个转录本归到谁名下，而归属直接决定下游的细胞分型、通讯分析与通路结论能不能站得住。这一篇专讲这个最容易被忽略、却最要命的环节。

一、空间组学的"单细胞"，不是一个分辨率等级，而是一次归属

先厘清一件事。空间组学说的"单细胞分辨率"，落到实处其实是两个动作：把组织上的细胞一个一个分出来，以及把检测到的分子信号一个一个挂到对应的细胞上。前者是分割，后者是归属。很多讨论只盯着"多少个指标""单个细胞检出多少转录本"，却跳过了第一步——如果细胞本身就被分错了，后面算得再精细也是错的。

分割之所以难，是因为细胞本身就没有标准形状。细胞核大小相近、形状规整，是很好用的锚点；细胞质则完全相反——形态多变、大小差异大、边界梯度弱，相邻细胞贴在一起时几乎分不出界线。更棘手的是，很多细胞膜上表达的分子在固定后的 FFPE 组织里已经掉了，形态学染色能稳定提供的往往只有核染加几个标记。

这就引出了两条路线：一条是从核出发、按某个固定半径向外扩展；另一条是用膜蛋白抗体把真实轮廓染色出来，再结合核位置与 RNA 分布联合判定。

二、核扩增的问题不是"不够准"，而是会系统性偏向某些结论

核扩增在 Visium 与部分成像平台上被广泛使用，实现简单、速度快，所以问题常被低估。更准确的说法是：它不是在所有场景下都差，而是误差有方向性——它系统性地把某些结论推向特定方向，而不是随机噪声。

第一个方向：细胞类型比例被拉偏。在一份胶质瘤样本的多组学整合研究里，研究者用单细胞测序参考去检验互斥标志基因对的共现情况。少突胶质细胞标志物 MOBP 与免疫/血管标志物 ARHGDIB 在 scRNA-seq 参考中几乎不同细胞共表达（低于 2%）；换成核分割后升到 9%，细胞形态分割升到 23%，而核扩增分割达到 30%。也就是说，用核扩增做出来的数据里，两个本该互斥的细胞类型，会有三成的细胞被算成"同时表达两者"。

第二个方向：细胞通讯与免疫相关结论被削弱。低丰度细胞是核扩增最容易误伤的对象——转录本少，信号弱，一旦边界画大就被邻近高丰度细胞吞掉。有研究在肾细胞癌数据集上对比不同分割策略时发现，核分割能给出更高的 T 细胞比例，而核扩增与转录本推断法都明显压低了这个数字；T 细胞的中位转录本数只有 64，远低于巨噬细胞（180）和肿瘤细胞（226）。而 T 细胞浸润恰恰是免疫治疗研究里最关键的读数之一。

第三个方向：细胞类型注释整体偏。在人脑 FFPE 样本中，用 Xenium 默认的 5 微米核扩增重新分割后，转录本分配率从纯核分割提升到 65.21%，细胞类型注释在两种分割间的一致性为 88.6%；但血管脑膜细胞（VLMC）这一簇在扩展分割中整体消失，被并入了内皮细胞——两者在神经血管单元里位置紧邻，扩展半径一大就把它们混作一类。把扩展距离缩到 2.5 微米才能把它找回来。这不是几个细胞的问题，是一整类生物学信息的丢失。

第四个方向：表面标志基因被稀释。核扩增本质上是把核周围一圈都算作细胞质，这会稀释定位于细胞膜的标志信号。做免疫检查点分析时，PD-1、PD-L1 这类膜分子的强度会因为"摊薄"而偏低。同样的道理，一个只在细胞膜表达的基因在核分割下可能被整个漏掉。

三、SMI 的做法：先用形态学染色把边界画出来，再谈表达

CosMx SMI（空间分子成像仪）走的是另一条路。它的细胞分割基于增强的 CellPose 算法，把细胞膜蛋白、细胞核与 RNA 信号三路信息联合起来判定边界，而不是单纯靠核的位置去猜形状。原生提供五通道多路免疫荧光，用基于抗体的形态学标记捕捉细胞形态，再把转录本分配到正确的细胞里；蛋白与多组学分析场景下，则把高复杂度蛋白图像与机器学习分割模型结合，确保细胞边界检测与细胞分型的准确性。

这段流程在软件界面上的呈现很直观：形态学原图、分割结果、转录本归属三步并列，你能直接看到每一个细胞的圈是怎么画出来的，以及每个分子的落点。这是核扩增给不了的——它的边界本身没有可供核对的形态学依据。

这项能力在形态复杂的组织里价值最大。上皮肿瘤的间质、成纤维细胞密集的纤维化区域、神经元所在的脑组织，都是"核与胞体分离、形状不规则"的高发场景；而骨髓这种细胞极度密集、多核细胞常见的组织，核扩增几乎无法处理，多核细胞只能靠细胞形态分割才能识别出来。

四、真单细胞的数据，能多问出哪些问题

分割准确带来的不只是"数据更干净"，而是一批原本做不了的分析变得可做。

第一，细胞通讯分析才有意义。配体与受体的共定位判断，前提是"这是同一个细胞发出的信号、那是另一个细胞收到的信号"。边界一错，邻居关系就是错的，通讯网络整张图都要重画。

第二，罕见细胞亚群不会被漏掉。在肿瘤微环境里占比不足 1% 的亚群，恰恰常是研究目标。低丰度细胞在核扩增下最容易被邻近细胞吞掉，等于研究目标被系统性地抹掉。

第三，亚细胞定位有了坐标基础。SMI 在亚细胞尺度成像：核、胞质、细胞膜各自可分，转录本的定位精度可达几十纳米级，分辨率约 120 纳米；同时支持八层 Z 轴立体扫描，能看到信号在细胞内的立体分布。多数平台能告诉你"这个基因高表达"，SMI 还能告诉你"它高表达在细胞的哪个部位"——这对于区分膜上表达与胞内表达、判断信号通路是否处于激活态，是决定性的。

第四，跨样本比较才站得住。细胞组成比例是空间组学最常被引用的输出之一。一旦比例被分割方式系统性带偏，任何"治疗前后免疫浸润增加"的结论都可能只是分割差异。多中心研究里样本条件更难统一，对分割稳健性的要求只会更高。

五、和其他平台怎么分工

把几个平台放在一起看，分工其实很清楚。

需要全景概览、不追求单细胞归属，用 Visium 或 Stereo-seq 一类的测序型平台。捕获面积大、无偏覆盖全转录组，适合组织图谱构建、空间可变基因识别这类发现型工作，代价是捕获单元内的信号是混合的。

需要"假说驱动"的定点深挖，用 DSP 一类的 ROI 策略平台。形态标记引导下手工圈选区域，把预算集中在明确假设上；代价是区域内的细胞是混合检测的，回答不了"这个区域里到底是哪一簇细胞在做什么"。

需要"数据驱动"的单细胞定量，就是 SMI 与 Xenium 这一类成像型平台的定位。成像范围上，SMI 单次覆盖 20×15 毫米共 300 平方毫米，Xenium 为 10.45×22.45 毫米共 234 平方毫米；两者都是真正的单细胞尺度定量，依赖后续数据挖掘。指标数上 SMI 提供 1K、6K 与全转录组三档 RNA 检测，配合 70 余种蛋白检测；Xenium 提供 1K、5K 与 19K 档位。

值得注意的是，不同来源的横向比较研究给出的结论并不完全一致。有的评测认为 SMI 在炎症组织等特殊部位更灵敏、在不同实验条件下表现更稳定、基因检出率更高，适合多中心使用；也有评测指出 Xenium 更依赖样本质量指标、在更高重数时表现有所下滑。比较研究报告的样本量与组织类型差异不小，结论需要结合自己的样本条件判断，不宜照搬。

六、样本与实验准备：分割再准，也救不回坏的切片

需要说清楚的是，SMI 解决的是"边界怎么定"，不解决"信号还在不在"。FFPE 组织里 RNA 降解、蛋白抗原丢失，膜标记染不上色，形态学边界就失去了依据——这时再先进的算法也无从判断。所以样本质量仍然是把关的第一道门。

切片要求：常规使用 5 微米厚 FFPE 或新鲜冷冻切片，切片须平整无褶皱、位于载玻片中央；每个样本建议切多张以备重做。

固定要求：离体后应尽快固定，10% 中性缓冲福尔马林或 4% 多聚甲醛均可，避免过度固定导致的抗原交联影响膜标记结合。

蜡块年限：三年以内的蜡块经验证无明显问题；十年以上的老蜡块，蛋白与 RNA 完整性都需自行验证，形态学标记尤其可能失效。

视野与效率：SMI 按视野（FOV）成像，可按需选择扫描区域，支持多视野拼片以覆盖目标区域。整机每周可扫描两到四张切片，多轮成像的机制决定了它不像测序型平台那样无限扩量，需要在项目初期就把 FOV 数量规划好。

七、常见问题

问：核扩增和膜标记分割，实际数据差距有多大？

差距集中在细胞类型比例与标志基因特异性上，而不是整体转录本数量。在前述胶质瘤研究中，互斥标志基因对的异常共现率从 scRNA-seq 参考的 2% 以下，升到核分割的 9%、形态分割的 23%、核扩增的 30%。换句话说，差异不大到让数据"不能用"，但足以让某个具体结论反转方向。

问：SMI 也是靠算法分割，那和"猜"有什么区别？

区别在于算法拿到的输入信息不同。核扩增只拿到核的位置和一个固定半径，等于在缺少形态学证据的情况下强行给出一个边界；SMI 拿到的是膜标记染出来的真实轮廓，加上核位置与 RNA 分布的联合证据。前者的边界没有可供核对的形态依据，后者有——而且在软件界面上逐细胞可查、可复核、可人工修正。这一点在做严肃课题时价值很高：出问题时你知道该去看哪里。

问：单细胞分辨率的空间平台，是不是都比测序型"高级"？

不是。测序型平台在无偏覆盖和通量上有成像型难以比拟的优势，适合做发现型研究；而成像型的价值在于把结论锚定到具体细胞上。常见路径是：先用测序型平台扫出空间图谱与候选区域，再用成像型平台在关键区域做单细胞深挖。两者是分工，不是替代。

问：什么课题值得优先考虑这条路？

三个信号：其一，需要回答"哪个细胞在做什么"，而不只是"这个区域表达什么"；其二，需要细胞通讯、免疫检查点、细胞亚群这类依赖细胞归属的分析；其三，样本形态复杂或细胞密集，比如纤维化间质、肿瘤浸润前沿、神经组织、骨髓。反过来，如果目标只是比较几个明确区域的整体表达差异，ROI 策略平台更快也更省。

八、总结

"真单细胞"不是一个分辨率标签，而是关于归属质量的承诺。核扩增用猜出来的边界把转录本分给细胞，膜标记辅助分割用测出来的边界把转录本分给细胞——两种做法都能给出"单细胞"的数据，但由此得到的细胞比例、通讯网络与亚群结论，稳健性不在一个量级。

SMI 的技术选择很明确：把形态学标记、细胞核与 RNA 信号三路信息结合起来，让细胞边界成为可核对的产物。在肿瘤微环境、免疫治疗评估、罕见亚群发现这类"结论必须落在具体细胞上"的课题里，这一步是数据可信度的地基。

原文链接：SMI「真单细胞，不是猜的」：膜标记辅助分割