关键词：溃疡性结肠炎，HDX-MS，MKK3别构调节

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性复发性肠道炎症疾病，TNF-α虽为临床验证的治疗靶点，但现有药物以注射用生物制剂为主，口服小分子仍属空白。传统针对p38 MAPK 通路的 ATP 竞争性抑制剂因激酶组选择性差、脱靶毒性等问题在临床试验中屡遭失败；MKK3 作为 p38 的主要上游激活激酶，被视为更具选择性的替代靶点，但其小分子开发极为有限，非 ATP 竞争性调节剂更是处于空白。此前报道的 TAK1-MKK3 蛋白-蛋白相互作用抑制剂 (R)-STU104 虽在动物模型中展现出良好的抗 UC 疗效，却存在代谢稳定性差的成药性缺陷。本研究旨在保留其独特非 ATP 竞争性机制的前提下，通过结构优化与成药性改造，获得兼具高活性与优良 DMPK 性质的候选分子。

文献解析

研究成果展示      

▶ 在线预发表时间：2026年10月20日

▶ 期刊：Journal of Medicinal Chemistry（影响因子：7.3）

▶ 文章标题：

Design and Synthesis of Novel, Non-ATP-Competitive MKK3 Modulators as Suppressors of TNF-α Production for the Treatment of Ulcerative Colitis

▶ 核心内容：

复旦大学联合团队，近期在《Journal of Medicinal Chemistry》在线发表研究成果"Design and Synthesis of Novel, Non-ATP-Competitive MKK3 Modulators as Suppressors of TNF-α Production for the Treatment of Ulcerative Colitis"，该研究基于前期发现的TAK1-MKK3 PPI抑制剂(R)-STU104，通过系统的结构导向设计与多维度成药性优化，成功获得口服生物利用度高、代谢稳定性优异的高效候选分子(R)-48，通过氢氘交换质谱（HDX-MS）分析，系统阐明了(R)-48通过结合MKK3远端C叶别构口袋、阻断TAK1介导的MKK3激活，从而抑制TNF-α产生并治疗溃疡性结肠炎的非ATP竞争性分子机制。百蓁生物为此项研究提供了HDX-MS分析服务。

研究方法

本研究综合运用了基于结构的药物设计与化学合成（对茚酮骨架进行A、B、C三区SAR探索与手性拆分）。通过多维度优化成功获得了兼具高活性、高选择性的候选分子 (R)-48。 随后，结合体外分子与细胞水平评价（SPR、CETSA检测靶点结合，ADP-Glo酶学实验评估催化抑制，RAW264.7细胞模型测定TNF-α抑制活性）及氢氘交换质谱（HDX-MS）与分子对接解析空间构象。研究发现，该分子实现了高亲和力结合（KD = 3.35 nM）与催化抑制缺失（IC50 > 10 μM）的显著背离，HDX-MS 揭示其真实结合于 MKK3 远端 C 叶别构口袋，通过阻断上游 TAK1 激活来抑制下游 p38 通路，而非直接占据 ATP 位点。 最后，通过DSS与TNBS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型，结合药代动力学（PK）与药效学（PD）分析评估体内疗效。 (R)-48 展现出 62.6% 的高口服生物利用度，并在两种模型中均产生明确的剂量依赖性治疗作用及良好的PK/PD相关性。

图1. 候选分子 (R)-48 的发现流程与作用机制概览

研究结果

1. 获得高活性、高口服暴露且代谢稳定的候选分子 (R)-48

通过针对代谢“软点”的结构导向设计与A/B/C三区SAR优化，研究团队从(R)-STU104骨架出发成功获得了(R)-48。该分子对LPS刺激细胞产生TNF-α的抑制活性达 IC50 = 0.038 μM（较先导物提升>15倍），对MKK3的SPR结合亲和力达 KD = 3.35 nM（提升20余倍）。同时，其在小鼠体内的口服生物利用度高达 62.6%，在肝微粒体中高度稳定，且对81种激酶展现出极干净的靶点选择性（10 μM下抑制均<25%）。

图2. (R)-48 的体外活性、体内药代动力学及 PK/PD 相关性

2.HDX-MS与酶学数据协同揭示“非ATP竞争性”的远端C叶别构结合模式

研究团队对比无配体状态（apo-MKK3）与结合状态（(R)-48/MKK3 复合物）的氘摄取差异（ΔRFU），HDX-MS 结果显示了两处显著的保护区域：一处是ATP 结合口袋区域；另一处则是 C叶的远端别构区域（该区域此前在 MAPK8、MAPK10 与 MAPK14 等激酶中也有鉴定）。

图2. 相对氘摄取（RFU）差值图

结合前述酶学实验“催化抑制可忽略”的阴性结果，研究团队推断：ATP 区域的氘交换保护并非源于药物分子的直接空间占据，而是由于药物结合在远端别构位点后，诱发了蛋白构象的传播变化（allosteric conformational propagation），进而导致 ATP 口袋区域发生结构紧缩。因此，(R)-48 的真实结合位点被锁定在 C 叶远端的别构口袋中。

图3. (R)-48 结合引起的氘交换保护映射至 MKK3 结构模型

分子对接（Docking）结果显示，(R)-48 与 (S)-48 在该远端 C 叶口袋中的结合姿态存在巨大差异，这从结构层面完美解释了二者在细胞水平上 47 倍的活性差异（eudismic ratio）。同时，尽管 MKK1-MKK7 家族成员结构相似，但该远端别构口袋周围的氨基酸残基存在细微差异，正是这种“非保守性”，赋予了 (R)-48 对 MKK3 极高选择性的结构基础。

图4. (R)-48 和 (S)-48 与 MKK3（AF-P46734）的分子对接

3. 在两种溃疡性结肠炎动物模型中证实显著的体内药效与PK/PD相关性

在DSS诱导和TNBS诱导的两种小鼠UC模型中，(R)-48均表现出明确的剂量依赖性治疗作用（改善体重、恢复结肠长度、降低DAI评分、减轻病理损伤），并显著抑制血清和结肠组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23水平。其中，3 mg/kg/d的(R)-48疗效即优于一线药物50 mg/kg/d的美沙拉嗪。系统的PK/PD分析证实，其游离药物暴露量与治疗疗效呈强正相关。

图5. (R)-48 在 DSS 诱导的急性 UC 模型中表现出显著的剂量依赖性治疗效果

研究结论

本研究基于先导化合物 (R)-STU104，通过结构优化与成药性改造，成功开发出非 ATP 竞争性候选分子 (R)-48。借助 HDX-MS 等技术，明确了其结合于 MKK3 远端 C 叶别构口袋，通过阻断 TAK1 激活，高选择性抑制 p38 通路及 TNF-α 产生。(R)-48 具备优异的口服生物利用度（62.6%）与激酶选择性，在两种 UC 小鼠模型中展现出明确的剂量依赖性疗效，3 mg/kg/d 剂量即优于一线药物美沙拉嗪。该研究为变构激酶调节剂的设计提供了成功范式，并将 (R)-48 确立为极具潜力的口服抗溃疡性结肠炎候选药物。