WGBS多组学揭示DNMT1 CXXC结构域保护CpG岛低甲基化的双重机制
2026-11-11 来源:本站 点击次数:24
DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）是维持基因组DNA甲基化稳态的关键酶。先前研究揭示了DNMT1的甲基化活性主要发生在H3K9me3富集的转座元件等异染色质区域，而在CpG岛（CpG islands，CGIs）等低甲基化环境中受到抑制，但DNMT1如何“感知”低甲基化核小体环境以限制CGI甲基化，这种“环境选择性”的分子机制长期不明。
近日，加州大学河滨分校宋吉奎教授与杜克大学王刚教授团队合作，在《Nature Communications》期刊发表题为“The DNMT1 CXXC domain senses CpG islands for DNA methylation inhibition”的科研论文。研究通过冷冻电镜（cryo-EM）结构解析、体外生化实验、以及CUT&Tag、WGBS、LC-MS/MS、RNA-seq等多组学整合分析，揭示了DNMT1的CXXC结构域通过识别未修饰CpG位点，将DNMT1固定在自抑制构象，抑制TRD靶识别结构域、无法接近DNA底物，从而保护CGI避免异常高甲基化的分子机制。破坏CXXC-CpG互作会导致DNMT1在CGI区过度活跃，引发发育关键基因Atf4、Gata6、Neurog1、Csf2ra异常高甲基化、H3K27me3标志减少，并导致胚胎干细胞分化严重缺陷。
标题：The DNMT1 CXXC domain senses CpG islands for DNA methylation inhibition（DNMT1 CXXC结构域感知CpG岛以抑制DNA甲基化）
发表时间：2026-09-18
发表期刊：Nature Communications
影响因子：IF18.1/Q1
技术平台：CUT&Tag、WGBS、LC-MS/MS、RNA-seq等（易基因优势技术）
作者单位：加州大学河滨分校、美国杜克大学
DOI:10.1038/s41467-026-77872-8
本研究首先分析了DNMT1与含未修饰CpG位点的核小体（umNCP）复合体的冷冻电镜结构，发现DNMT1的CXXC结构域与核小体核心区或连接体中的未修饰CpG位点互作，增强DNMT1与核小体结合、促进其在CpG岛富集。同时，CXXC结构域会阻止DNMT1的靶标识别结构域接近潜在的DNA底物，形成自抑制构象。破坏CXXC-CpG互作会导致DNMT1在未修饰CpG核小体上过度活跃，并减少对邻近半甲基化CpG的维持性甲基化。
全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）分析显示，尽管整体基因组甲基化增加幅度不大，但CXXC-CpG互作缺失型DNMT1突变（MutKQ）会特异性导致CpG岛甲基化显著增加，从而导致转录程序和干细胞分化严重缺陷。本研究确定了CXXC结构域在保护CpG岛低甲基化中的作用，确立其“感知低甲基化环境、保护CpG岛低甲基化”功能，是发育过程中DNA甲基化稳态的重要保障。
图形摘要：DNMT1介导DNA甲基化在不同染色质环境中的调控模型
高甲基化环境中，DNMT1招募和DNA甲基化活性在H3泛素化（H3Ub2+）调控下增强，但由于UHRF1活性受限及CXXC结构域介导的自抑制，其增强程度显著低于低甲基化环境中。而在H3Ub2调控缺失（H3Ub2-）下，自抑制状态的DNMT1相对富集于CpG岛（CGI），且部分归因于CXXC-CpG互作。
研究方法
1、结构生物学
冷冻电镜解析DNMT1与含未修饰CpG的核小体（umNCP，带H3Ub2/H4K20me3修饰）复合体结构，包括野生型（WT）及MutKQ突变体两套结构
2、生化实验
EMSA、BLI结合实验，体外DNA甲基化动态检测（kcat、Km、Vmax）
3、分子机制研究
CUT&Tag：在DNMT1敲除的mESC（1KO-mESCs）中回补3×Flag标签的野生型（WT）或突变体（MutKQ）DNMT1，绘制DNMT1全基因组结合图谱；并进行H3K27me3 CUT&Tag
WGBS：全基因组DNA甲基化分析，鉴定DMC/DMR
LC-MS/MS：定量检测基因组5mC水平
转录组：解析MutKQ引起的转录程序改变与干细胞分化缺陷，并将hyper-DMR关联基因做GO富集分析。
关键图形
图1：CUT&Tag揭示野生型（WT）DNMT1对高GC含量基因组区域（尤其是CGI）的优先靶向，而CXXC-CpG互作缺陷突变体（MutKQ）则表现出与相应区域的结合减少。
a. 回补验证western blot；
b. 野生型DNMT1与具有指定基因组特征区域的结合富集热图；
c,d. 野生型和MutKQ DNMT1的结合与CpG密度之间的相关性小提琴图；
e. 野生型和MutKQ DNMT1的CUT&Tag信号的平均图和热图；
f. 野生型和MutKQ在CGI ±5kb的DNMT1结合metagene图，显示MutKQ在CGI处结合减少。
图2：LC-MS/MS与WGBS揭示CXXC-CpG互作抑制DNMT1，从而保护CGI低甲基化。
a. 亲本Dnmt1敲除小鼠胚胎干细胞（1KO-ESCs）和野生型（WT）Dnmt1或Dnmt1 MutKQ突变体重构细胞进行全局5mC水平LC-MS/MS定量检测；
b. 1KO-ESCs与WT DNMT1的差异甲基化CpG位点（DMCs）比较DMC火山图；
c. 不同基因组注释特征中高甲基化DMCs的富集热图；
d. CGIs、CGI岸区和其他基因组区域中高甲基化DMCs比例饼图；
e. 所示基因组注释特征中单个CpG位点DNA甲基化差异箱线图；
f. MutKQ与WT DNMT1在mESCs中的高甲基化差异甲基化区域（hyper-DMRs）和低甲基化差异甲基化区域（hypo-DMRs）数量；
g. 不同基因组注释特征中hyper-DMRs的DMRs富集热图；
h. MutKQ与WT DNMT1的mESCs在CGI区域的整体DNA甲基化水平metagene图，显示MutKQ细胞在CGI处出现特异性高甲基化峰。 
图3：WGBS和CUT&Tag整合分析揭示DNMT1 MutKQ诱导的DNA高甲基化。
a. MutKQ与WT DNMT1的mESCs中高密度DMRs的平均DNA甲基化水平（上；基于WGBS）和DNMT1结合情况（下；基于CUT&Tag）；
b,c. WT或MutKQ DNMT1细胞中，CpG密度与甲基化水平之间的相关性；
d. 注释的CpG岛（CGIs）的分布和绝对计数条形图；
e. WT（蓝色）和CXXC缺失型MutKQ（红色）细胞在孤儿CGIs与启动子CGIs上的平均DNA甲基化水平小提琴图（上），每个CGI位点直接甲基化变化的扩展分布（下）。
f. 按Polycomb染色质状态将CGI分为H3K27me3-（活跃/未标记）和H3K27me3+（PcG抑制）队列，并分层分析CGI总数（n）的分布和绝对计数。
g. 比较H3K27me3+和H3K27me3- CGI之间基线和突变体部分甲基化分布小提琴图（上）、直接位点间甲基化方差（Δ=MutKQ-WT）（下）；
h. 1KO-mESCs中Atf4和Csf2ra基因位点的DNA甲基化（WGBS）和DNMT1结合（CUT&Tag）IGV轨迹；
i. MutKQ DNMT1 mESCs中与高甲基化差异区域（hyper-DMRs）相关基因的GO富集气泡图。
图4：DNMT1 CXXC结构域对小鼠胚胎干细胞（mESCs）分化至关重要。
a. 拟胚体（EB）形成后第0天、第3天和第5天分化过程的RNA-seq主成分分析（PCA）；
b. WT-DNMT1、MutKQ和1KO样本在所有时间点的谱系特化和多能性基因标记表达热图。
c. 基因集富集分析（GSEA）图谱；
d,e. 亲本1KO-mESCs或用WT DNMT1或MutKQ突变体重建的1KO-mESCs的EB大小定量（d）和EB代表性图像（e）；
f. 分化后第5天野生型DNMT1、MutKQ突变体或1KO的mESCs形成的EBs中的谱系标记基因RT-qPCR检测；
g. 分化后第6天野生型DNMT1、MutKQ突变体或1KO的mESCs经视黄酸（RA）诱导分化后的指定神经元谱系标记基因RT-qPCR检测。
结论和启示
本研究通过结构生物学和表观基因组学WGBS、CUT&Tag等实验揭示了DNMT1 CXXC结构域感知CpG岛的分子机制。CXXC识别未修饰CpG使DNMT1富集于CGI环境感知和靶向，同时将TRD阻挡于底物之外，表现为自抑制构象，从而双重保护CGI低甲基化。即使H3Ub2解除RFTS介导的自抑制后，CXXC-CpG仍然自抑制，构成UHRF1-H3Ub2轴多层调控。
参考文献：
Fang J, Pan B, Ren W, Lu J, Zhao T, Guo Y, Cai L, Wang Y, Wang GG, Song J. The DNMT1 CXXC domain senses CpG islands for DNA methylation inhibition. Nat Commun. 2026 Sep 18;17(1) doi: 10.1038/s41467-026-77872-8.
近日，加州大学河滨分校宋吉奎教授与杜克大学王刚教授团队合作，在《Nature Communications》期刊发表题为“The DNMT1 CXXC domain senses CpG islands for DNA methylation inhibition”的科研论文。研究通过冷冻电镜（cryo-EM）结构解析、体外生化实验、以及CUT&Tag、WGBS、LC-MS/MS、RNA-seq等多组学整合分析，揭示了DNMT1的CXXC结构域通过识别未修饰CpG位点，将DNMT1固定在自抑制构象，抑制TRD靶识别结构域、无法接近DNA底物，从而保护CGI避免异常高甲基化的分子机制。破坏CXXC-CpG互作会导致DNMT1在CGI区过度活跃，引发发育关键基因Atf4、Gata6、Neurog1、Csf2ra异常高甲基化、H3K27me3标志减少，并导致胚胎干细胞分化严重缺陷。
标题：The DNMT1 CXXC domain senses CpG islands for DNA methylation inhibition（DNMT1 CXXC结构域感知CpG岛以抑制DNA甲基化）
发表时间：2026-09-18
发表期刊：Nature Communications
影响因子：IF18.1/Q1
技术平台：CUT&Tag、WGBS、LC-MS/MS、RNA-seq等（易基因优势技术）
作者单位：加州大学河滨分校、美国杜克大学
DOI:10.1038/s41467-026-77872-8
本研究首先分析了DNMT1与含未修饰CpG位点的核小体（umNCP）复合体的冷冻电镜结构，发现DNMT1的CXXC结构域与核小体核心区或连接体中的未修饰CpG位点互作，增强DNMT1与核小体结合、促进其在CpG岛富集。同时，CXXC结构域会阻止DNMT1的靶标识别结构域接近潜在的DNA底物，形成自抑制构象。破坏CXXC-CpG互作会导致DNMT1在未修饰CpG核小体上过度活跃，并减少对邻近半甲基化CpG的维持性甲基化。
全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）分析显示，尽管整体基因组甲基化增加幅度不大，但CXXC-CpG互作缺失型DNMT1突变（MutKQ）会特异性导致CpG岛甲基化显著增加，从而导致转录程序和干细胞分化严重缺陷。本研究确定了CXXC结构域在保护CpG岛低甲基化中的作用，确立其“感知低甲基化环境、保护CpG岛低甲基化”功能，是发育过程中DNA甲基化稳态的重要保障。
图形摘要：DNMT1介导DNA甲基化在不同染色质环境中的调控模型
研究方法
1、结构生物学
冷冻电镜解析DNMT1与含未修饰CpG的核小体（umNCP，带H3Ub2/H4K20me3修饰）复合体结构，包括野生型（WT）及MutKQ突变体两套结构
2、生化实验
EMSA、BLI结合实验，体外DNA甲基化动态检测（kcat、Km、Vmax）
3、分子机制研究
CUT&Tag：在DNMT1敲除的mESC（1KO-mESCs）中回补3×Flag标签的野生型（WT）或突变体（MutKQ）DNMT1，绘制DNMT1全基因组结合图谱；并进行H3K27me3 CUT&Tag
WGBS：全基因组DNA甲基化分析，鉴定DMC/DMR
LC-MS/MS：定量检测基因组5mC水平
转录组：解析MutKQ引起的转录程序改变与干细胞分化缺陷，并将hyper-DMR关联基因做GO富集分析。
关键图形
a. 回补验证western blot；
b. 野生型DNMT1与具有指定基因组特征区域的结合富集热图；
c,d. 野生型和MutKQ DNMT1的结合与CpG密度之间的相关性小提琴图；
e. 野生型和MutKQ DNMT1的CUT&Tag信号的平均图和热图；
f. 野生型和MutKQ在CGI ±5kb的DNMT1结合metagene图，显示MutKQ在CGI处结合减少。
图2：LC-MS/MS与WGBS揭示CXXC-CpG互作抑制DNMT1，从而保护CGI低甲基化。
b. 1KO-ESCs与WT DNMT1的差异甲基化CpG位点（DMCs）比较DMC火山图；
c. 不同基因组注释特征中高甲基化DMCs的富集热图；
d. CGIs、CGI岸区和其他基因组区域中高甲基化DMCs比例饼图；
e. 所示基因组注释特征中单个CpG位点DNA甲基化差异箱线图；
f. MutKQ与WT DNMT1在mESCs中的高甲基化差异甲基化区域（hyper-DMRs）和低甲基化差异甲基化区域（hypo-DMRs）数量；
g. 不同基因组注释特征中hyper-DMRs的DMRs富集热图；
h. MutKQ与WT DNMT1的mESCs在CGI区域的整体DNA甲基化水平metagene图，显示MutKQ细胞在CGI处出现特异性高甲基化峰。
图3：WGBS和CUT&Tag整合分析揭示DNMT1 MutKQ诱导的DNA高甲基化。
b,c. WT或MutKQ DNMT1细胞中，CpG密度与甲基化水平之间的相关性；
d. 注释的CpG岛（CGIs）的分布和绝对计数条形图；
e. WT（蓝色）和CXXC缺失型MutKQ（红色）细胞在孤儿CGIs与启动子CGIs上的平均DNA甲基化水平小提琴图（上），每个CGI位点直接甲基化变化的扩展分布（下）。
f. 按Polycomb染色质状态将CGI分为H3K27me3-（活跃/未标记）和H3K27me3+（PcG抑制）队列，并分层分析CGI总数（n）的分布和绝对计数。
g. 比较H3K27me3+和H3K27me3- CGI之间基线和突变体部分甲基化分布小提琴图（上）、直接位点间甲基化方差（Δ=MutKQ-WT）（下）；
h. 1KO-mESCs中Atf4和Csf2ra基因位点的DNA甲基化（WGBS）和DNMT1结合（CUT&Tag）IGV轨迹；
i. MutKQ DNMT1 mESCs中与高甲基化差异区域（hyper-DMRs）相关基因的GO富集气泡图。
图4：DNMT1 CXXC结构域对小鼠胚胎干细胞（mESCs）分化至关重要。
b. WT-DNMT1、MutKQ和1KO样本在所有时间点的谱系特化和多能性基因标记表达热图。
c. 基因集富集分析（GSEA）图谱；
d,e. 亲本1KO-mESCs或用WT DNMT1或MutKQ突变体重建的1KO-mESCs的EB大小定量（d）和EB代表性图像（e）；
f. 分化后第5天野生型DNMT1、MutKQ突变体或1KO的mESCs形成的EBs中的谱系标记基因RT-qPCR检测；
g. 分化后第6天野生型DNMT1、MutKQ突变体或1KO的mESCs经视黄酸（RA）诱导分化后的指定神经元谱系标记基因RT-qPCR检测。
结论和启示
本研究通过结构生物学和表观基因组学WGBS、CUT&Tag等实验揭示了DNMT1 CXXC结构域感知CpG岛的分子机制。CXXC识别未修饰CpG使DNMT1富集于CGI环境感知和靶向，同时将TRD阻挡于底物之外，表现为自抑制构象，从而双重保护CGI低甲基化。即使H3Ub2解除RFTS介导的自抑制后，CXXC-CpG仍然自抑制，构成UHRF1-H3Ub2轴多层调控。
参考文献：
Fang J, Pan B, Ren W, Lu J, Zhao T, Guo Y, Cai L, Wang Y, Wang GG, Song J. The DNMT1 CXXC domain senses CpG islands for DNA methylation inhibition. Nat Commun. 2026 Sep 18;17(1) doi: 10.1038/s41467-026-77872-8.
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