COLD-PCR和高分辨率溶解结合使用，高效的筛查和鉴定癌症基因低水平的未知突变

研究背景：

癌症中体细胞分子层面的突变，常常需要在大量野生型DNA中辨识低浓度的DNA突变。但是，突变检测方法的选择率和灵敏度常常限制了鉴定低浓度突变的可靠性。最近开发的COLD-PCR（低变性温度下的复合扩增，李等人。2008）解决了低含量基因突变检测的一些局限性，在PCR扩增过程中利用关键变性温度丰富含有突变的扩增子，不论突变位于序列的什么地方。COLD-PCR的一个主要属性是富集突变体以便于在PCR后的直接测序。然而碱基测序仍然是昂贵的选择，从而通过高通量扫描序列预检是有吸引力的办法。高分辨率融解（HRM）是一种可用于预筛查测序之前未知突变的技术，但不能确定具体的检测基因突变的身份。因此，为了富集、快速筛查和鉴定低浓度的未知突变，我们把HRM突变扫描和COLD-PCR相结合，随后进行已知突变的直接测序鉴定。

方法：

一系列稀释的HCC2157细胞系和SW480 (ATCC)细胞雄株基因组DNA准备用于评估方法的灵敏度。
TP53基因的外显子7和8通过常规PCR和COLD-PCR进行扩增。COLD-PCR使用较低的变性温度（低于扩增变性温度~1℃）来优先扩增在序列上含有突变的DNA。使用Cepheid SmartCycler II PCR仪。
对PCR扩增产物中存在的突变随后通过HRM在LightScanner HR96 (Idaho Technologies Inc.)上进行筛选
扩增产物在美国Dana - Farber研究所分子生物学的核心机构进行测序，验证突变的位点和类型。
这种方法使用人类肺腺癌手术的DNA样本进行评价。

系列稀释为检测HRM灵敏度

常规PCR扩增子的HRM分析，具有一个突变检测极限，4.0%到10.0%（外显子7）。(图1A)

COLD-PCR扩增子的HRM分析，具有一个突变检测极限，0.25%到1.0%（外显子7）。(图1B)

这证明通过COLD-PCR-HRM方法进行检测,比常规PCR-HRM法灵敏度提高了10-20倍
TP53基因外显子7比外显子8的扩增效率低,这是由于两者存在不同的熔化区域.(数据没列出)

肺肿瘤的HRM分析
TP53基因第7外显子，常规PCRP-HRM和COLD-PCR-HRM两种方法都发现所有7种已知突变，（图2）两种方法均有野生对照组。

TP53基因第8外显子，常规PCR-HRM可靠地检测出6个低含量的突变，但3个得分为“未知”，这表明可能存在突变。
COLD-PCR扩增产物的HRM分析确认了所有的9种低含量的突变，（图3）包括通过常规PCRHRM分类为“未知”的三种突变。

序列分析：

这里评价的16个突变，半数无法通过常规PCR的扩增产物可靠地测序确定
COLD-PCR扩增产物的序列分析准确定义外显子7里94%的突变和100%的外显子8突变。代表测序图见图4。

尽管通过COLD-PCR对突变进行富集，一个突变（样本TL78）不能通过测序来鉴定，可能是目前是TP53基因外显子7的扩增产物中突变检测的底限。我们推测TL78的突变在野生等位基因间的小于1%。