长读长测序技术，例如 PacBio HiFi 测序，正在迅速成为基因组学研究的新黄金标准。

长读长测序是一种核酸测序类型，它能够产生单独的读取（read），这些 read 各自来自于一个长度为数千个核苷酸或更长的单个DNA分子，从而生成基因组数据。长读长测序能够检测长度为1,000到20,000个碱基或更长的DNA（或RNA）片段。这些片段通常来自于“原生”分子，这些分子是直接从生物样本中提取出来进行分析的。相比之下，大多数短读长测序技术只能检测50-300个碱基长度的片段。与大多数长读长方法不同，短读长测序解决方案无法有效地对原生分子进行测序，并且在分析之前需要对提取的DNA进行扩增。

PacBio 测序技术是一种进阶版长读长测序技术，称为高度准确的长读长测序或 HiFi reads。目前仅有 PacBio 可提供准确度 > 99.9% 的 HiFi reads 测序技术，其准确度与短读长测序和 Sanger 测序相当。HiFi reads 可以让您在解决棘手的生物学问题时，无需再以牺牲读长为代价换取高准确度测序。

Fiber-seq

Fiber-seq 是一种多组学长读长检测技术，通过甲基转移酶标记开放染色质 + PacBio HiFi 长读长测序，在单分子水平同时读出基因组序列、5mC甲基化与染色质可及性，支持核小体定位、TF足迹、单倍型染色质构象与共激活分析。

实验流程

将分离出的细胞核用N6 - 腺嘌呤甲基转移酶（6mA-MTase）对细胞核内裸露 DNA 进行标记，开放区域优先被修饰，核小体 / 蛋白质结合区因不可及而保持未修饰。经过标记步骤后，终止反应，提取高保真长片段 DNA并进行文库制备，随后应用Pacific Biosciences HiFi 测序平台，通过直接或原生DNA（amplification-free，无需核酸扩增）测序方案进行测序。将可及位点（6mA峰）映射到单分子序列上，从而推断染色质开放与核小体位置。Fiber-seq 检测技术可用于单倍型定相染色质可及性图谱绘制，以及内源性CpG DNA 甲基化（DNAme）谱分析。

Fiber-seq实验流程

实验准备注意事项
（以使用EpiCypher CUTANA™ Hia5 for Fiber-seq 甲基转移酶体系为例）

• 起始样本投入

  - 新鲜分离、未固定的细胞核。
  - 参考人的基因组大小，需要准备约1百万的细胞核，考虑到细胞核分离过程有损失，需要准备至少2百万的高活性的细胞（建议细胞活率大于80%）。如果研究的是其他物种，如基因组较小的物种，建议投入更大量的细胞核，才能匹配1百万个人类细胞核的总DNA含量，这样做可以确保标记的一致性，并为长读长测序提供足够的 DNA。（例如小鼠基因组2.7G，其大小约为人类基因组的84%，建议细胞核投入量120万）

• 文库测序建议

  人类基因组样本建议每个样本测90 G，约30 x的基因组覆盖度。检测 6mA 和内源性 DNA 甲基化（5mC）需要采用原生或直接长读长测序技术。Fiber-seq 技术与短读长测序流程不兼容，因为甲基化标记会在 PCR 扩增过程中丢失。如果需要单倍型定相数据，则需要样本测序达到每个单倍型 30× 覆盖度（即二倍体细胞类型需达到 60× 覆盖度）。

相较于做染色质可及性分析的另一种技术ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，即利用转座酶研究染色质可及性的高通量测序技术），Fiber-seq 在同一套长读数据中可获得 ATAC-seq 无法提供的多类信息，包括一次测序同时读出序列、6mA（可及性）与 5mC。

Fiber-seq以 6mA-MTase 标记开放区，可以避免Tn5 转座酶的酶切偏好与 PCR 偏差，长读长覆盖 SNP/Indel 并与表观信号联合，可完成单倍型特异性染色质分析。

下表从多个维度上对比了这两种测序技术。

Fiber-seq作为一项突破性技术，可以从单个DNA长分子上同步读取多重信息，其中PacBio公司的HiFi测序是 Fiber-seq的技术基础和实现高质量数据的保障，可以说 Fiber-seq 是“站在HiFi的肩膀上”，将HiFi的长读长和高精度优势发挥到了极致，解锁了在单分子水平上同步解读基因组、表观基因组和三维基因组的全新能力。

北京怡美通德科技发展有限公司是PacBio的官方授权代理商，代理美国PacBio公司生产的Vega桌面式三代测序系统，提供仪器配套的试剂耗材供货、产品演示实验、产品安装、使用培训以及售前售后技术咨询、生物信息学分析等相关技术服务。

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