传统的Perturb-seq技术（结合CRISPR筛选与单细胞RNA测序）是解析基因功能的强大工具，能够系统性地将遗传扰动映射至分子表型，对特定调控因子亚群进行表型分析，可在单次实验中揭示多种不同扰动对转录状态的影响，但将其扩展至全基因组筛选时面临显著的成本与通量挑战。若进行有目标的筛选：需预先选择少量基因进行扰动，这会丢失发现新调控因子的能力；若进行无偏见的全基因组筛选：则需要对数百万细胞进行测序，成本极其高昂，且大部分测序资源浪费在无表型效应的扰动上。因此，急需一种能常规化、低成本进行全基因组单细胞扰动筛选的新方法。

2026年2月14日，纽约基因组中心研究团队在线发表了题为“Genome-wide single-cell perturbation screens with VIPerturb-seq”的预印本文章，开发了一种名为VIPerturb-seq的集成化的新型单细胞扰动筛选平台，构建了一个与多种表型富集策略完全兼容的全基因组扰动测序系统。通过使用10x Genomics单细胞GEM-X Flex v1和Flex Apex（Flex v2）产品，大幅降低了实验成本，提升了通量和数据质量，突破了传统Perturb-seq技术在全基因组广度与实验成本/通量之间的根本矛盾，通过方法学创新与商业化平台的巧妙结合，解决了全基因组单细胞扰动筛选在成本、通量和实验灵活性上的核心难题，使其从一个昂贵、小众的技术，转变为有望被单个实验室常规使用的强大发现工具。

该技术通过两大关键方式突破现有局限：首先，其兼容固定样本，支持多种表型富集模式，使研究人员可在单细胞分析前选择性富集目标表型细胞（重要扰动细胞）。仅这些富集细胞会进入成本敏感的文库制备和测序环节，无需预先设定扰动目标即可大幅减少待分析细胞数量。其次，该流程采用组合索引技术，通过同时标记转录本的微孔条形码和液滴条形码，实现大规模数据集的高效生成。

化“直接识别”为“组合解码”

不再让探针直接读取冗长且多变的gRNA序列本身，而是为每个gRNA配发一个独特的“分子身份证号”。这个身份证号由左（LHS）、右（RHS）两段较短的条形码片段组合而成。通过一套预先设计好的、不到500个定制探针库，系统可以像查字典一样，通过检测到的LHS和RHS组合，反向解算出原始gRNA的身份。这种“分裂探针-组合条形码”的设计，使得用极有限的探针资源（<500个）精准识别海量扰动（>5万个）成为可能，从根本上攻克了探针检测难以规模化应用的难题。

以“规模效应”颠覆“单细胞成本”

在解决检测难题的同时，依托10x Genomics Chromium GEM-X Flex Apex（Flex v2）平台本身具备的单通道即可处理百万级细胞的超高通量能力，通过“预索引”步骤，在生成液滴前为细胞添加孔特异性条形码。这使得多个细胞可以共享一个液滴，再通过计算进行解卷积，从而将单次运行的细胞通量提升50倍以上（从传统方法的数万细胞提升至单通道超40万细胞），显著降低了每个细胞的最终检测成本。这对于需要覆盖全基因组、每个基因又需一定细胞重复数的单细胞CRISPR筛选而言，是使其从“昂贵的概念验证”到“常规的科研工具”的关键一步。

10x Genomics Chromium Flex平台采用独特的 “基于探针的检测”技术路线，契合了全基因组单细胞扰动筛选所面临的两大核心挑战：样本兼容性与检测可扩展性。

• 兼容固定样本：其split-probe的设计对RNA完整性要求较低，可耐受细胞固定、透化处理，这是实现“先染色富集、后测序”流程的前提；
• 高灵敏度与特异性：split-probe需要左右两个探针同时正确结合并连接才能产生信号，这极大地减少了非特异性背景，即使在RNA部分降解的固定样本中也能获得高质量数据；
• 灵活可定制：可轻松添加自定义探针，用于检测合成条形码（如VIPerturb-seq的gRNA标识符）或整合蛋白标记（ADT），在同一反应中获取转录组和蛋白表型信息；
• 通量可扩展：Flex Apex（Flex v2）的组合索引设计，为突破传统通量极限提供了基础。

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实验结果

• 技术可行性验证

- 成功实现多模态检测，在单细胞水平同时测得mTOR信号通路标记蛋白（pRPS6）的变化。
- 在K562、HEK293、HAP1细胞系中，gRNA分配准确率>95%，单细胞转录组数据与金标准数据集高度一致。
 

• 全基因组无偏筛选实现

- 使用GuEST-List文库（57,050 sgRNAs）在K562细胞中完成筛选。
- 结合Flex v2组合索引，单次实验通量提升20-50倍，处理约88万细胞，每个细胞检测基因数增加65%（达5,300个基因）。
- 从数据中复现了NMD、mTOR、m6A甲基化等已知功能模块，并发现UVSSA等基因的新调控关系。

• 表型富集筛选示范

以Vimentin蛋白高表达为表型，通过FACS富集前3%细胞（约1.2万细胞）进行筛选。鉴定出Rag-Ragulator-FLCN营养感应复合物为该蛋白的新型负调控因子，富集倍数达10-63倍，并经独立实验验证。

随着单细胞扰动筛选技术持续成为生物学领域增长最快的检测模式之一，提升其可及性对最大化其影响力至关重要。通过将表型富集、组合索引和可扩展的探针扰动读取技术整合到统一平台中，VIPerturb-seq为常规全基因组扰动测序提供了极具吸引力的解决方案。研究人员预计该框架将有助于推广单细胞扰动筛选技术的应用，并加速跨生物学背景的基因与变异功能系统性图谱构建。VIPerturb-seq的灵敏度、可扩展性与效率既能满足具有特定研究问题的独立实验室需求，也可支持旨在构建虚拟细胞的大型数据生成平台。

参考文献：

bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.64898/2026.02.12.705613; this version posted February 14, 2026. 

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