Lightscanner 和Lightscanner32 非标记探针法基因分型
载脂蛋白（ApoE）多重实验

密码子112（T>C）
密码子158（C>T）

实验背景

      载脂蛋白（ApoE）是一种糖蛋白，包括299个氨基酸，在身体调节胆固醇水平上起主要作用。胆固醇水平过高是冠心病的主要因素，在美国，冠心病是引起死亡的主要因素。ApoE与老年痴呆症也有关系，这种病是因为大脑额叶萎缩，造成神经衰弱。老年痴呆症的普遍表现是痴呆，而且是不能治愈、退化、终端的。ApoE基因有两个SNPs，位于密码子112（c.388 T>C）和158（c.526 C>T）。密码子112和158组合的基因型翻译3种不同类型的蛋白质，通常称为：ε3（正常），ε2（异常），和ε4（异常）。
      
                     
• ε2等位基因与高脂蛋白血症遗传缺陷类型Ⅲ相连锁，增加或减少动脉硬化的风险。
• 在群体中，近似于64%的人有ε3等位基因，此等位基因被认为是“中性”的ApoE基因型。
• ε4等位基因与动脉硬化和老年痴呆症有关系，损害认知功能，减少神经突分支。

方法

      基因分型的同类PCR方法一般需要荧光标记的核苷酸探针，我们用3’端封闭的，非标记探针（Luna Probes）及LC Green饱和染料生成探针下基因型特有的熔解曲线。此方法的关键是不平衡PCR引物的比例，此比例导致不对称PCR或过量产生一条单链（实验中探针的目的链），这样才可以生成足够的信号。
       需要以下的试剂建立成功来得Lightscanner仪器。

准备样品

      高分辨率熔解曲线（HRM）对比的是独立的PCR反应的熔解图，因此，将反应之间的变化最小化是非常关键的。要用HRM分析的样品必须用相同的提取平台提取。这样就排除了不同提取平台最后洗脱buffer之间的试剂组成的微小不同。做HRM实验，建议10ul体系基因组DNA模板的含量是10-20ng。

实验设计

注：带下划线的红色字体显示的是SNP位点在非标记探针中的位置。“block”显示的是C3封闭，阻止
探针的3’端延伸。 根据112探针的小的特征，设计其与目的链错配来改变探针的Tm值。这样允许在同
一反应中，112和158探针的温度有差异。                                              

反应体系

96孔板操作

按照以下步骤操作：
1. 在每个孔中加25 μL矿物油。
2. 将没有模板的PCR混合液加入每个孔（9 μL）。
3. 加入DNA模板（每个孔1 μL）。
4. 用封口膜封闭96孔板。
5. 2000-3000rpm离心，至少1分钟。
      将96孔板放入PCR仪。

扩增Protocol（模块加热）

在Lightscanner仪器上扫描样品，运行以下熔解参数：
起始温度：50℃；结束温度：97℃；自动曝光。

扩增Protocol（LS32）

基因分型结果（Lightscanner）

基因分型结果（Lightscanner32）

 
参考文献
Poulson MD, Wittwer CT. Closed-tube genotyping of apolipoprotein E by isolated-probe PCR with multiple unlabeled probes and high-resolution DNA melting analysis, Biotechniques. 2007;43(1):87–91.