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Western blot免疫蛋白印迹法的发展、应用及传统湿转跟半干转优缺点

2022-06-20     来源:中科通仪     点击次数:6672

WB最初是由Towbin等人于1979年提出,并称之为免疫印迹法(immunoblotting)[1]
后于1982年由Burnette将免疫蛋白印迹法称为Western Blotting[2]。
 


使用含8M尿素的18%聚丙酰胺凝胶分离大肠杆菌核糖体总蛋白后分别进行考凝胶马斯亮染色(图A)与膜上蛋白印迹酰胺黑染色(图B)
 

 
Western Blot应用[3]:

1、检测细胞中目的蛋白的表达:通过WB 技术直接检测干细胞分化、细胞自噬、细胞凋亡、周期蛋白、DNA损伤修复、分子诊断标志物等关键通路蛋白,可评估细胞或机体所处的生物学状态。
2、对基因的功能缺失研究:通过敲减或过表达目的基因后,用WB 技术检测相关通路蛋白的表达变化,以确定目的基因激活或抑制目的蛋白的表达调控关系,探究信号通路。
3、研究目的蛋白所处的细胞定位:蛋白的分选投递与发挥功能是基因调控的结果,因此改变了某些基因的活性,或化学修饰可能会影响其效应蛋白的转运,改变细胞核质中的分布,引发不同的生物学效应。
4、药物处理、代谢类的研究:
      
 
5、蛋白相互作用类研究:通过WB可检测Co-IP、RIP、CHIRP等实验的IP产物,研究目标蛋白-蛋白,RNA-蛋白之间的相互作用。
 
Western Blot法实际上是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术,其核心在于把WB转膜。

WB转膜是将通过电泳分离后的蛋白转移到固相载体上,如PVDF膜。我们常用电泳印迹法进行蛋白转移,电泳转移的方式分为湿转和半干转。两者虽然名称不一,但是原理是一样的,使用三明治结构(即滤纸-膜-凝胶-滤纸的结构),在电场正负极作用下将带负电的蛋白从凝胶转移至载体膜上。蛋白呈现负电的原因是因为蛋白等电电PI一般为6,在溶液中PH>PI时蛋白呈负电[4]。
 

传统湿转跟半干转,各有优缺点。100KD以下蛋白适用半干转,且半干转速率快。因为半干转的电流不会侧漏,全都在滤纸之间,所以转的效率比较高,速度快,缺点是有效离子浓度衰减快,可能几分钟就耗尽了,这个时候大蛋白还没来得及转上,再加上产热大,可能烧糊。相反的,湿转则是有效电流少,不全在滤纸之间,会从缓冲液间侧漏,所以转的效率低下,速度就慢了,但是有效离子浓度高,能够长时间进行转膜,因此适用于100KD以上的大分子蛋白的转膜。那么能不能既能有效减少电流侧漏的同时,又不断补充有效离子的方法呢?有,中科通仪就做到了。

中科通仪自主研发生产的专利产品M-Blot快速转膜仪是湿转和半干转的结合,从根本上解决了传统湿转和半干转的一些问题。
 

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1.Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1979, 76(9):4350-4.
2.Burnette W N . "Western Blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A[J]. Analytical Biochemistry, 1981, 112(2):195-203.
3.https://www.sohu.com/a/470319795_121124540
4.Fawcett J S . Isoelectric fractionation of proteins on polyacrylamide gels[J]. FEBS letters, 1968, 1(1):81-82.
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