题目：
使用T目标液相色谱-T和质谱快速检测血液培养中大肠杆菌或肺炎克雷伯菌中β-内酰胺、氨基糖苷和氟喹诺酮耐药机制

文章名称：
Using T argeted Liquid Chromatography-T andem Mass Spectrometry to Rapidly Detectβ-Lactam, Aminoglycoside, and Fluoroquinolone Resistance Mechanisms in Blood Cultures Growing E. coli or K. pneumoniae High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry and Parallel Reaction Monitoring Increases Sensitivity for Clinical Biomarker Quantitation from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tumor Biopsies

期刊：bioRxiv

发表日期：
2022- 02-10

Abstract:
New and rapid antimicrobial susceptibility/resistance testing methods are required for bacteria from positive blood cultures. In this study, a multiplex-targeted liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) assay was developed and validated for the detection of β-lactam, aminoglycoside, and fluoroquinolone resistance mechanisms in blood cultures growing Escherichia coli or Klebsiella pneumoniae complex. Selected targets were the β-lactamases SHV , TEM, OXA-1-like, CTX-M-1-like, CMY -2-like, chromosomal E. coli AmpC (cAmpC), OXA-48-like, NDM, VIM, and KPC; the aminoglycoside-modifying enzymes AAC(3)-Ia, AAC(3)-II, AAC(3)-IV , AAC(3)-VI, AAC(60)-Ib, ANT(200)-I, and APH(30)-VI; the 16S-RMT ases ArmA, RmtB, RmtC, and RmtF; the quinolone resistance mechanisms QnrA, QnrB, AAC(60)-Ib-cr; the wildtype quinolone resistance determining region of GyrA; and the E. coli porins OmpC and OmpF . The developed assay was evaluated using 100 prospectively collected positive blood cultures, and 148 negative blood culture samples spiked with isolates previously collected from blood cultures or isolates carrying less prevalent resistance mechanisms. The time to result was approximately 3 h. LC-MS/MS results were compared with whole-genome sequencing and antimicrobial susceptibility testing results. Overall, there was a high agreement between LC-MS/MS results and whole-genome sequencing results. In addition, the majority of susceptible and non-susceptible phenotypes were correctly predicted based on LC-MS/MS results. Exceptions were the predictions for ciproflox acinand amoxicillin/clavulanic acid that matched with the phenotype in 85.9 and 63.7% of the isolates, respectively. T argeted LC-MS/MS based on parallel reaction monitoring can be applied for the rapid and accurate detection of various resistance mechanisms
in blood cultures growing E. coli or K. pneumoniae complex.

研究背景
从阳性的血液培养中快速识别细菌种类，并进行快速抗菌素敏感性/耐药性测试，对于早期选择血流感染患者最合适的治疗至关重要。使用一种可用的样品制备方法和随后的基质辅助激光解吸/飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析，可在血液培养呈阳性后半小时内进行细菌物种鉴定。目前现有的分析方法虽然已经发现了大约10个耐药基因，但它们仍然没有发现其他相关的耐药机制，包括小谱青霉素酶和赋予氟喹诺酮类和氨基糖苷类耐药的机制。使用LC-MS/MS，可以检测到导致耐药性的实际蛋白质，而不是编码基因，这对于检测数量重要的耐药机制或仅检测基因不能提供足够信息的耐药机制尤其有用。此外，有针对性的LC-MS/MS分析可以高度复用，适用于一次运行检测数百个目标。在本研究中，我们开发并验证了一种快速LC-MS/MS分析方法，用于同时检测血液培养中大肠埃希菌或肺炎克雷伯菌复合物中27种常见的β-内酰胺、氨基糖苷和氟喹诺酮耐药机制。

研究方法
1. 前瞻性采集血液培养
于2019年10月19日至2020年7月19日对伊拉斯谟MC医学微生物学系革兰氏阴性杆菌阳性的血液培养进行前瞻性采样。共采样了 144 个连续培养物。此后，只排除来自同一患者的重复样本，总共剩下100个样本。

2. 血培养呈阴性
为了评估LC-MS/MS在检测不太常见的耐药性机制方面的准确性，作者在148份阴性的血液培养标本中加入了耐药性机制不太普遍的分离株。在标记阴性血液培养前，在- 80◦C保存的分离物在5%羊血TrypticaseTM大豆琼脂II板上继代培养，在37◦C孵育过夜。随后，将每种悬液各1ml加入阴性血液培养瓶中，使用BACTEC FX自动血液培养系统培养一夜，随后用Sepsityper试剂盒与前瞻性采集的血液培养物相同的方法进行预处理。

3. 鉴定和药敏试验
除不动杆菌属(Acinetobacter sp.)由CRBIP提供鉴定数据外，所有分离株均在Erasmus MC进行继代培养和AST鉴定。采用MALDI质谱进行鉴定。

4. 全基因组测序及耐药基因鉴定
采用Microsynth AG对前瞻性收集的(n = 100)和预先收集的(n = 100)血液培养物进行全基因组测序(WGS)。其余48株已通过WGS鉴定。测序采用Illumina NextSeq 500/550测序系统，使用NextSeq 500/550高输出试剂盒v2.5进行300次循环。

5. 检测方法的发展:耐药机制的选择
选择了大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对阿莫西林、第三代头孢菌素、碳青霉烯类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类耐药的最普遍的抗菌药物耐药机制。对氟喹诺酮类药物的耐药机制选择了AAC(60)-Ibcr、QnrA、QnrB和GyrA野生型QRDR。最后筛选出大肠杆菌的孔蛋白OmpC和OmpF。共筛选出27种不同的抗生素耐药机制。

6. 方法开发:肽选择
选择特异性肽用于检测每种耐药机制，并将其纳入检测方法。对于SHV、TEM、OXA-1-like、CTX-M-1-like、QnrA和QnrB，首先在硅材料中选择候选肽)、。然后，对所有候选肽进行实验测试，并将最高强度和低干扰的最佳性能肽纳入分析。所有多肽的稳定同位素标记(SIL)多肽变体被纳入分析优化。

7. 分析方法的开发:稳定同位素标记肽的浓度和检测标准
在先导实验的基础上，实验设置SIL多肽的浓度，使其接近内源性多肽的浓度。此外，设置以下标准，即质量误差<10 ppm, rdotp >0.95，内源性与SIL肽>比值0.01。

8. 试验开发:(非)敏感性预测标准
根据检测到的多肽来预测分离株的易感或不易感，应用以下预测规则。肺炎克雷伯菌和天花克雷伯菌均被认为对氨苄西林具有内在耐药性TEM或SHV的存在被预测只会导致氨苄西林不敏感。OXA-1的存在被预测会导致对氨苄西林和阿莫西林克拉维酸不敏感。对于氨基糖苷类，应用了与之前报道相同的预测规则。QnrA、QnrB或AAC(60)-Ib-cr的存在，或GyrA野生型QRDR的缺失，都可能导致环丙沙星不敏感。

9. 裂解和消化方法
为了验证分析结果，将储存的败血症微球(即阳性血培养物使用败血症试剂盒进行预处理)悬浮在50µl溶解液中，随后，添加所有纳入肽的SIL变异体。使用布兰森2510超声清洗剂超声5分钟，在80◦C和450 rpm下孵育10分钟。为了停止蛋白质消化，加入20µl的5%三氟乙酸，在37◦C和450 rpm下孵育样品5min。最后，4◦C 21000 × g离心10 min，上清液250µl转移到Eppendorf管中，-20◦C保存。

10. 液相色谱- t质谱分析
对于每个样品，20个消化液µl按照制造商的说明书和之前的描述装载到Evotips上。LC-MS/MS 使用与 Orbitrap 质谱仪(Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap，Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)耦合的 Evosep One(Evosep，Odense，Denmark)进行。采用制造商11.5分钟(100个样品/天)的分离方法进行分析。Q Exactive HF系统在PRM模式下工作。依次测量样品，在测量间隙不冲洗色谱柱。在方法验证过程中使用了以下设置，即四极隔离窗口为0.6 m/z单位，自动增益控制目标值为1 × 106离子，最大填充时间为150 ms，在400 m/z时分辨率为15000。所有多肽的归一化碰撞能为27%。每个肽的保留时间窗口为2min。

11. 数据分析
Skyline每日版本20.1或更高版本用于MS分析。检测开发完成后，使用达·芬奇实验室解决方案(荷兰鹿特丹)开发的定制软件工具“抗生素耐药性扫描仪”分析Skyline的结果。通过使用该工具，Skyline结果被导入，并根据应用的检测标准进行自动化评估。

研究结果及讨论
在之前的研究中，作者证明了使用LC-MS/MS高精度检测不同碳青霉烯酶和氨基糖苷类耐药机制的可能性。在这些研究中，通过检测选定的特异性多肽来确定耐药机制，并使用SIL多肽进行自动化分析。此外，利用内控肽进行样品质量评估和自动化分析。在这项研究中，在培养大肠杆菌或肺炎克雷伯菌复合分离株的阳性血液培养中，应用类似的条件来检测这些和额外的耐药机制，从而省去了耐药测试之前的再培养/分离步骤，从而导致结果的时间显著缩短(图1)。为了扩大耐药机制的覆盖范围，TEM、SHV、CTX-M、将OXA-1、QnrA和QnrB多肽添加到先前选定的靶标上。图2为TEM和CTXM的LC-MS/MS光谱示例。在初步实验中，我们验证了所有27种选择的耐药机制都能在11.5 min的梯度内检测到。在此条件下，所有248株分离株都能检测到。
 

图1. 从阳性血液培养到结果的当前方案概述
 

图2. 选择用于TEM和CTX-M的多肽的阳性和阴性LC-MS/MS谱

1. 分析验证:质量评估和样品排除
设置质量控制参数，排除质量不合格的样品。最低要求是每个蛋白检测1个SIL多肽，3个内质控肽均检测到(大肠杆菌和克雷伯氏菌)。在248个样本中，3个前瞻性收集的样本(其中2个混合培养)和1个加标样本(在使用MALDI-TOF进行鉴定之前，也需要更广泛的提取方案)被排除，因为在初始和重复测量中都遗漏了多个SIL多肽。

此外，排除了其他三个前瞻性采集的样品(其中一个混合培养)，其中至少有一个内部质量控制肽没有检测到。因此，我们使用241个样品进行分析。

2. 分析验证:质谱分析结果与全基因组测序结果的比较
将LC-MS/MS对剩余241份样品的抗性机制检测结果与WGS的结果进行比较。对于β-内酰胺酶CTX-M-1-like、OXA-1、CMY-2-like和4种碳青霉烯酶KPC、OXA-48、NDM和VIM，与WGS分析相比，灵敏度为100%。在106株含有TEM基因的分离株中，104株检测到β-内酰胺酶。66株携带SHV基因的分离株中有7株未检测到SHV β-内酰胺酶。在155个大肠杆菌分离株中，有11株检测到AmpC β-内酰胺酶的染色体编码。除了对β-内酰胺酶的高敏感性外，该方法对CTX-M-1-like、OXA-1、NDM和VIM的特异性为100%，对SHV的特异性为96.6%，对TEM的特异性为95.6%，对CMY-2-like的特异性为98.7%，对KPC的特异性为99.1%，对OXA-48的特异性为99.6%。

16SRMTases和AMEs对氨基糖苷类耐药机制的敏感性均为100%，AMEs对AAC(3)-Ia、AAC(3)-IV和AAC(3)-VI的敏感性分别为100%。在其他AMEs中，AAC(3)-II的敏感性为97.6%，AAC(60)-Ib为97.7%，ANT(200)-Ia为90.9%，APH(30)-VI为66.7%。RmtB、RmtC、RmtF、AAC(3)-IV、AAC(3)-VI、APH(30)-VI的特异性为100%，ArmA、AAC(3)-Ia、ANT(200)-Ia的特异性为99.6%，AAC(3)-II的特异性为98.0%，AAC(60)-Ib的特异性为99.5%。

对氟喹诺酮耐药机制的敏感性，QnrA为80.0%，QnrB为84.6%，AAC(60)-Ibcr为100%。野生型QRDR检测的总灵敏度为82.8%，大肠杆菌为80.6%，肺炎克雷伯菌和水痘克雷伯菌为86.0%。野生型QRDR、QnrA、QnrB和AAC(60)-Ibcr的特异性分别为100%、100%、99.1%和99.5%。除了GyrA野生型QRDR区域定义肽的检测外，其他耐药机制在不同细菌种类的比较中测试性能无差异。

3. 分析验证:差异分析
为了研究LC-MS/MS和WGS之间的差异结果，所有假阴性的PRM结果都被手动重新分析，以区分弱信号或发散信号与无光谱。在大多数假阴性结果的样本中，没有发现匹配的光谱。例外情况为:1株菌株SHV检测到微弱信号或发散信号，1株菌株AAC(60)-Ib检测到微弱信号，1株菌株APH(30)-VI检测到微弱信号，2株菌株QnrB检测到发散信号。在所有分离株中，检测到的光谱rdotp值低于0.95，与SIL多肽的比值低于0.01。

对于有假阳性肽鉴定的样品，通过人工重新分析和重新测量来区分携带肽、检测背景噪声或清晰光谱，表明相应的基因可能没有被WGS检测到。CMY-2-like、KPC、ArmA、AAC(3)-II和ANT(200)-Ia的假阳性命中和QnrB的一个假阳性命中表明是在初始样本分析中结转的结果，即由于高阳性样本先于阴性样本。此外，SHV的两种鉴定和TEM的一种鉴定，OXA-48-like、AAC(3)-Ia和QnrB在重新测量时没有被鉴定出来，这可能是由于检测到背景噪声或Evotips初始预处理或加载时的样品污染造成的。然而，其他5个TEM鉴定、4个SHV鉴定和AAC(60)-Ib鉴定均被证实，重新测量显示的光谱与“真阳性”相似，表明这些耐药机制的存在，而相应的基因未被WGS检测到。

4. 分析验证:质谱结果与抗菌药物敏感性T检测结果的比较
将液相色谱-串联质谱结果与VITEK 2结果进行比较，以评估建立的检测方法在预测(非)对所选抗生素敏感性方面的能力(表4)。在亚胺培南、美罗培南、庆大霉素和妥布霉素的敏感表型预测中，超过97.0%的菌株与VITEK 2一致。

此外，93.0%氨苄西林、94.0%阿莫西林-克拉维酸、91.7%头孢噻肟和93.7%头孢他啶的易感表型预测结果与VITEK 2一致。75.7%的菌株对环丙沙星敏感。97.4%的氨苄西林分离株的不敏感表型预测结果与VITEK 2结果一致，而阿莫西林-克拉维酸分离株的不敏感表型预测结果仅与VITEK 2结果一致，而阿莫西林-克拉维酸分离株的不敏感表型预测结果与VITEK 2结果一致。此外，头孢噻肟91.0%、头孢他啶92.3%、美罗培南100%、亚胺培南100%、庆大霉素95.4%、妥布霉素98.6%、环丙沙星93.9%的分离株预测结果一致。

对于β-内酰胺和氨基糖苷不正确的非易感预测(即主要错误)部分是由于结转造成的假阳性结果，例如，CMY、KPC或AAC(3)-II选择的多肽之一的结转。此外，虽然几种已鉴定的β-内酰胺酶确实导致最低抑制浓度(MICs)增加，但MICs仍属于敏感范畴。例如，在9个对头孢噻肟敏感的大肠杆菌分离株中发现了大肠杆菌cAmpC，其中3个分离株也对头孢他啶敏感。其中2株的mic≤0.12 mg/L，只有QPVTQQTLFELGSVSK在0.02或更小的比值下被检测到。在所有其他的cfc阳性分离株中，头孢他啶的两种多肽均检测到这一机制，其比例至少为0.60,mic≥1 mg/L，表明cAmpC表达，但不足以导致头孢噻肟耐药。因此，仅检测cAmpC多肽而不进行定量，无法准确预测这些分离株对头孢噻肟和头孢他啶的耐药性。

同样，OXA-48-like的存在被正确检测到，并导致mic高于美罗培南的筛选断点，但它没有导致3个分离株对亚胺培南和4个分离株对美罗培南产生耐药性，因为OXA-48限制了碳青霉烯酶活性，导致亚胺培南和美罗培南的mic有限增加。

根据目前耐药机制的存在或不存在，无法准确预测阿莫西林-克拉维酸的耐药性。在77株大肠杆菌和肺炎克雷伯菌复合菌株中，经LC-MS/MS鉴定仅含有SHV和/或TEM的β内酰胺酶，59株菌株具有阿莫西林-克拉维酸耐药。19株敏感菌株GyrA QRDR野生型肽假阴性，预测结果不敏感。

此外，在具有YHPHGDAAVYDTIVR、YHPHGDLAVYDTIVR或YHPHGDLAVYNTIVR的5个分离株中，正确地排除了QRDR野生型，但这只导致MIC略有增加(n = 4, MIC 0.12-0.25 mg/L)或根本没有增加(n = 1, MIC≤0.06 mg/L)。

不正确的易感预测(即非常重大的错误)主要是由所含多肽未涵盖的耐药机制引起的。例如，blaCTX−M−14、blaCTX−M−27和blha−1也导致氨苄西林和头孢菌素耐药，AAC(60)-Ie-APH(200)-Ia是唯一错误的托布霉素敏感预测。此外，在5个环丙沙星非敏感分离株中，发现了qnrS基因，而该检测中所包含的耐药机制不存在。

5. 蛋白分析
许多指示性抗生素被用于筛选特定的耐药机制。对于没有孔，没有合适的和具体的指示抗生素可用。因此，这种抵抗机制经常被忽略。孔道蛋白的缺失会使微生物对多种抗生素产生耐药选择，包括第三代头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素。因此，我们用多肽来筛选大肠杆菌中是否存在OmpC和OmpF。在大多数大肠杆菌分离株中，OmpC的4个多肽均被检测到(n = 127)。在21株大肠杆菌分离株中，3个肽段检测到OmpC, 5株分离株2个肽段检测到OmpC。只有2个分离株未检测到OmpC多肽，其中1个分离株也未检测到OmpF多肽。该特异性分离株对阿莫西林-克拉维酸、头孢噻肟和头孢他啶耐药，但未检测到β-内酰胺酶。84株大肠杆菌分离株中2个肽段检测到OmpF, 36株分离株中1个肽段检测到OmpF, 35株分离株中2个肽段均未检测到OmpF。

研究结论
综上所述，作者开发了一个有针对性的LC-MS/MS工作流程，可以检测各种β-内酰胺、氨基糖苷和氟喹诺酮耐药机制。结果表明，LC-MS/MS可用于快速检测阳性血培养菌的耐药机制。未来的工作应该集中在检测自动化、实验室实施和患者利益和成本效益的论证上。最后，可以将额外的多肽纳入对额外抗菌素(如甲氧苄啶-磺胺甲恶唑)的耐药性机制，以及其他细菌物种的耐药性机制，使开发的工作流程更加普遍适用。

参考文献
Foudraine, Dimard E., et al. "Using Targeted Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry to Rapidly Detect β-Lactam, Aminoglycoside, and Fluoroquinolone Resistance Mechanisms in Blood Cultures Growing E. coli or K. pneumoniae." Frontiers in Microbiology 13 (2022).

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