在药物研发的漫漫征途中，分子间相互作用的定量分析至关重要，快速寻找能够精准结合目标分子的小分子抑制剂或促进剂，一直是科学家们不懈追求的目标。传统的高通量筛选（HTS）技术虽能快速筛选大量化合物，但往往只能提供定性或半定量的结果，且存在大量假阳性和假阴性。传统定量方法（SPR, BLI, ITC）通常需要重复测量稀释系列，以便生成滴定曲线并测量平衡解离常数（Kd），但这些方法受限于它们在几十分钟范围内的中低通量能力，才可获得单个配体的解离常数。其中表面等离子共振（SPR）、生物层干涉法（BLI）虽然能够提供详细的结合亲和力和动力学信息，但基于表面的技术，需要复杂的表面化学优化，且对缓冲液兼容性和分析物的表面吸附敏感；等温滴定量热法（ITC）虽然是溶液中的技术，但需要大量的样品，对于珍贵或稀有的材料不够实用，这些限制促使科学家们寻找更高效、更通用的分析技术。如今，一种名为cSPRING（Continuous Titration Based Spectral Related Intensity Change）的新兴技术，它将FIDA（层流诱导分散分析）与光谱位移技术相结合，以在单个浓度样品中测量Kd，作为一种溶液内方法，可将样品制备时间减少8倍，并且仅需要纳克蛋白质。cSPRING可在一分钟内通过单浓度样品测量Kd，突出了其效率和筛选应用的潜力，有望对传统小分子定量筛选市场这一领域带来新的曙光。

技术原理
在深入了解 cSPRING 的优势之前，我们先来剖析两种技术——cSPRING 和 dSPRING 的实验设计和原理。在 dSPRING（离散滴定法）中，研究人员需要准备一系列不同浓度的分析物溶液，通常通过 2 倍稀释系列来实现。每个浓度点都需要单独测量，生成完整的滴定曲线。实验中，荧光标记的指示剂（如蛋白质）与不同浓度的配体混合后，通过Capflex方式进行检测。荧光信号呈高斯分布，通过双高斯拟合提取扩散系数和荧光强度，最终得到平衡解离常数（Kd）（Figure 1A）。

cSPRING（连续滴定法）技术基于FIDA（层流诱导分散分析）与光谱位移技术，通过在毛细管中自动创建连续的浓度梯度，实现对非共价相互作用的快速定量分析。具体来说，FIDA利用层流条件下荧光溶质的浓度分布，精确测定扩散系数和流体动力学半径。而cSPRING结合了FIDA和光谱位移检测，通过测量荧光团的发射光谱变化来反映分子间相互作用。实验中只需准备两个样品：一个是完全结合状态（高浓度分析物与指示剂混合），另一个是未结合状态（仅指示剂）。通过在毛细管中自动创建连续的浓度梯度，模拟传统的滴定曲线。配体在毛细管中以泰勒分散的方式形成时间依赖的浓度分布，而指示剂浓度保持恒定（Figure 1B）。
 

Figure 1 的展示，我们可以清晰地看到 cSPRING 和 dSPRING 在实验设计上的关键区别。dSPRING 更适合高精度的详细分析，而 cSPRING 则以其高效、快速的特点，成为高通量筛选的理想选择。

应用案例
文章中，研究人员选择了鸡卵清溶菌酶（HEWL）与三乙酰氨基葡萄糖（NAG3）作为模型体系。HEWL被标记上对环境变化敏感的Cy5荧光染料，当NAG3与HEWL结合时，荧光团的微环境发生变化，导致其发射光谱的比率变化。通过在两个光谱带（λ1=663–685 nm和λ2=685–737 nm）中测量荧光强度的比率（F2/F1），研究人员能够实时监测结合过程。

Figure 2 展示了cSPRING技术在HEWL-NAG3体系中的应用。图2A是一个dSPRING离散滴定曲线，显示了在不同NAG3浓度下，HEWL与NAG3结合的比率荧光信号变化，拟合得到的Kd值为7.2±0.7 μM，与文献报道的10 μM非常接近。图2B则展示了cSPRING实验中记录的荧光信号，通过拟合得到的Kd值为10.4±0.8 μM，与dSPRING的结果一致。图2C进一步验证了cSPRING的重复性和可靠性，三次重复实验的Kd值高度一致，平均值为10.4±0.8 μM。

为了进一步验证 cSPRING 技术的高效性和准确性，研究人员选择了牛碳酸酐酶 II（bCAII）作为模型体系。bCAII 是一种广泛研究的酶，它与多种小分子抑制剂的相互作用已被详细表征。

Figure 3 则展示了cSPRING技术在牛碳酸酐酶II（bCAII）与三种不同抑制剂（乙酰唑胺、呋塞米、4-羧基苯磺酰胺）体系中的应用。这些抑制剂的Kd值范围从20 nM到1 μM，cSPRING技术能够快速、准确地测定这些结合亲和力，并与文献报道的值高度一致。

Table 1 的数据表明，cSPRING 和 dSPRING 在测量非共价相互作用的解离常数（Kd）时具有高度一致性和可靠性。cSPRING 以其快速、高效、节省样品的特点，特别适合高通量筛选和初步评估，而 dSPRING 则适合对单个体系进行更详细的分析。这些方法与传统技术（如 SPR 和 ITC）的比较进一步验证了 cSPRING 的实用性和准确性。

为了进一步突出定量筛选能力，研究人员在更短的毛细管上进行 cSPRING 实验，且无需额外的清洗步骤，这使得单个平衡解离常数（Kd）值的测量时间缩短至 45 秒（图 4）。结果，对三种抑制剂进行三次重复测量用时不到 7 分钟，每种抑制剂仅消耗 4.2 微升指示剂溶液。
 

Figure 4 在更短的毛细管中进行的 cSPRING 实验，将单次测定平衡解离常数（Kd）的测量时间缩短至 45 秒。A - C 展示了三种不同抑制剂的 cSPRING 信号，以及拟合得到的平衡解离常数（Kd）和流体动力学半径。尽管结果的准确性降低，但定量读数提供了有价值的信息，并且仍与先前报道的亲和力相符。

cSPRING的优势

1. cSPRING技术的核心优势在于其高通量、快速定量的能力。与传统的滴定方法相比，显著提高了实验效率，由于该方法仅使用两个样品，样品制备时间缩短为原来的八分之一。这为在 96 孔板中定量筛选大量小分子文库腾出了空间。例如，两个 96 孔板足以测定 150 多个平衡解离常数（Kd），而采用离散实验设置则需要 1500 多个孔，需要大量的样品制备工作和相当多的样品量。
2. cSPRING技术对样品的需求极低，仅需纳克级的蛋白质，这对于珍贵或难以获取的样品具有重要意义。
3. cSPRING结合独特的FIDA与光谱位移技术，一方面可在毛细管中自动创建连续的浓度梯度，避免了繁琐的样品准备过程，另一方面可避免单独光谱位移技术容易受到背景荧光伪影的影响，而 cSPRING 通过分析高斯信号峰下的面积消除了这个问题，使其不受背景效应的影响。

结论
cSPRING技术以其高效、快速、精准的特点，为非共价相互作用的定量分析提供了一种全新的解决方案。它不仅大大减少了样品准备时间和实验成本，还能够提供与传统方法相媲美的准确结果。对于药物研发中的高通量筛选和定量分析，cSPRING无疑是一个极具潜力的工具。

参考文献
Philipp Willmer et al. "Continuous Titration Based Method for Rapid In‐Solution Analysis of Non‐Covalent Interactions." Chemistry Methods 2025.