一、细胞表面染色操作流程
①细胞计数
细胞计数:将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数;500g离心4min,去上清。
②制备单细胞悬液
将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬,400g离心3min,去上清,重复2次;用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl细胞悬液。
③(可选)阻断Fc受体
室温孵育10-20min。
④一抗孵育
每孔加入稀释后的一抗溶液100μl,2-8℃反应30min。
⑤洗涤
400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍。
⑥二抗孵育
对于非荧光染料直标抗体,加入100μl荧光二抗重悬,避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤8。
⑦ 洗涤
400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍。
⑧重悬细胞
用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞,4℃保存,上机分析。
二、细胞胞内染色操作流程
①细胞计数
将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数;500g离心4min,去上清。
②制备单细胞悬液
将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬,400g离心3min,去上清,重复2次;用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl细胞悬液,400g离心5min去上清。
③固定
每孔加入100μl细胞固定剂重悬细胞,2-8°孵育20min。
④洗涤
400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍。
⑤洗涤
每孔加入100μl细胞通透剂重悬细胞,室温孵育20min。
⑥洗涤
400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍。
⑦ (可选)阻断Fc受体:
10-20min。
⑧一抗孵育
每孔加入稀释后的一抗溶液100μl,2-8℃反应30min。
⑨洗涤
400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍。
⑩二抗孵育
对于非荧光染料直标抗体,加入100μl荧光二抗重悬,避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤11。
⑪洗涤
400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍。
⑫上机分析
用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞,4℃保存,上机分析。
菲恩生物/抗体
FineTest®antibody
● 可提供兔多抗、鼠单抗10000余种,每年新增研发抗体近千种;
● 验证应用:ELISA,WB,IHC,IF,IP等实验;100余种标记二抗;
● HRP、AP、Biotin、FITC、Alexa Fluor 488、CY3、荧光素等标记物。