红外(IR)光谱在酵母和细菌快速菌株分型方面的应用
2023-12-18 来源:本站 点击次数:1315用于菌株分型和鉴别的光谱检测解决方案
红外(IR)光谱展示了其在酵母和细菌快速菌株分型方面的应用前景，该方法有助于改善医疗保健机构积极主动的感染控制策略。
作者
Margie Morgan博士，Cedars-Sinai医学中心病理和检验医学科临床微生物学医学主任
Deisy Contreras博士，Cedars-Sinai医学中心病理和检验医学科临床微生物实验室临床副主任
Markus Meyer博士，布鲁克微生物与感染诊断部门 卫生与流行病事业部主管
引言
微生物耐药性(AMR)是人类面临的最大公共卫生威胁之一。1AMR不仅每年造成120多万人死亡，2还带来巨大的经济损失，并与疾病相关的发病率有关。尽管一些超级细菌已经成为著名的耐药微生物——比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和淋病奈瑟菌——但实际问题远比这些臭名昭著的案例更为严重，且感染也并不局限于细菌感染。
耳念珠菌是2009年在日本首次报道的一种酵母菌，3但对韩国血液分离株的回顾性分析表明，最早的已知病例发生在1996年。4今天，耳念珠菌可以危及生命，并已蔓延到六大洲的30多个国家5。耳念珠菌通常对所有三大类抗真菌药物(唑类、多烯类和棘白菌素类)都具有耐药性，并且很容易通过定植患者和受污染的表面和设备等途径在医院环境中传播。
2015年，美国首次报道了耳念珠菌。2020年7月，仅洛杉矶就累计发生了1000多例病例。6像在美国发生的耳念珠菌这样的多重耐药微生物的爆发表明，医疗机构需要能够快速识别微生物菌种的仪器，以便为正确的行动方针提供信息。
分型技术
传统的菌株分型技术，如脉冲场凝胶电泳、多位点序列分型、乳胶凝集和全基因组测序，需要耗费大量的时间和资源，而且不是所有的微生物实验室都已经具备这些技术。
易于应用的分型方法是快速可靠地表征耐药微生物的核心，而基于傅里叶变换红外光谱(FT-IR)的菌株分型技术正显示出很好的应用前景。与传统的方法相比，FT-IR使用相对简单，可实现高通量的菌株区分，每份样品的分析成本较低。FT-IR测量与红外光吸收有关的分子振动，不同化学结构的振动频率不同——例如，脂肪酸和脂质中的羧基振动频率为2800-3000 cm-1，而蛋白质中的酰胺基振动频率为1500-1800 cm-1。FT-IR通过测量整个波数范围内的吸收光谱来产生样品的分子指纹。微生物可以通过指纹图谱的变化进行分类，特别是多糖的吸收区域，这部分光谱提供了许多分子(如膜糖蛋白)中都存在的多糖结构信息。
明确的菌种鉴定
FT-IR技术可以与基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱技术相结合，同时用于微生物的鉴定。
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种可靠的技术，可用于直接对培养皿或患者血液培养物中的微生物进行种属水平的鉴定。通过主要分析核糖体蛋白，MALDI-TOF MS可以确定微生物独特的蛋白质指纹图谱，然后将得到的指纹图谱与参考库匹配来进行鉴定。强大且高性能的MALDI-TOF MS系统是最新技术发展的成果，它可以识别数千种微生物；有些可以在相同的工作流程中识别AMR的特定标志峰或活性。与传统的鉴定方法相比，7MALDI-TOF MS具有更高的准确性，获得结果的时间更快，成本更低，7因此在许多微生物实验室中得到了常规使用。
Cedars-Sinai医学中心的微生物鉴定及菌株鉴别
Cedars-Sinai医学中心是一个非营利的研究型医疗机构，服务于洛杉矶及其周边地区，该中心采取了综合措施来应对耳念珠菌的挑战。由于耳念珠菌与其它念珠菌有相似的特征，因此用传统方法或最新的荧光和生化检测方法都难以鉴定。因此，Cedars-Sinai的研究人员将注意力转向了能将耳念珠菌区分出来的创新方法，包括下一代测序法、红外光谱法和MALDI-TOF质谱法。
Cedars-Sinai医学中心所做的工作帮助引导了MS和IR两种方法在加州的临床应用，它是加州首个采购MALDI-TOF 质谱的实验室，通过质谱可在菌种水平上明确鉴定耳念珠菌。Cedars-Sinai也是美国首个将全新的FT-IR光谱系统用于更深入的菌株分型的医学中心。起初，他们主要将FT-IR光谱系统用于革兰氏阴性杆菌(如铜绿假单胞菌)和革兰氏阳性球菌(如金黄色葡萄球菌)的爆发分析，之后开始用于耳念珠菌的菌株分型和分类。
2019年，红外光谱就已成为Cedars-Sinai医学中心常规检测耳念珠菌的一种成熟方法，但COVID-19的出现给研究带来了前所未有的障碍，包括对旅行和进入实验室的限制。到2020年底，大部分资金都被用于抗击SARS-CoV-2（这是可以理解的），虽然该中心刚刚宣布，多重耐药耳念珠菌是医院和长期护理机构的重大威胁。Cedars-Sinai医学中心的研究人员决心建立一种检测耳念珠菌的方法，通过在入院前对高危患者进行检测来预防传播。
耳念珠菌的两步检测法
Cedars-Sinai的研究团队采取逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来鉴定耳念珠菌，以进行有价值的筛查，但为实现更高水平的监控，还需要进一步的检测。今天，Cedars-Sinai的研究人员采用两步检测法来诊断耳念珠菌。第一步:使用RT-PCR技术通过腋窝或腹股沟拭子检测耳念珠菌；RT-PCR的速度及其无需分离耳念珠菌的优点，使研究人员能够快速识别有风险的患者，并对其采取适当的隔离措施。第二步: 培养菌株，并通过红外光谱进行菌株分型。
该系统可将不同的念珠菌和其它酵母菌区分开来，可作为指导临床决策的早期预警系统。Cedars-Sinai的研究人员已从中看到了希望：最近他们使用了上述两步系统，在一年的时间里，从700多名高危患者中鉴定出28个耳念珠菌阳性标本，相当于4%的阳性率。8
该研究所已经建立了一个数据库，记录了Cedars-Sinai收治的每位耳念珠菌阳性的患者。这一宝贵资源将有助于迅速查明未来可能发生的疫情。
沙门氏菌鉴定
Cedars-Sinai的研究人员还利用MALDI-TOF质谱鉴定了自体干细胞移植患者的干细胞培养物中的沙门氏菌。9沙门氏菌感染是导致急性腹泻的主要原因，其临床表现从肠胃炎到危及生命的发烧。10发达国家近年来多次暴发的主要感染源是食物(通常是鸡蛋、肉类、乳制品和蔬菜)和水。2019年，美国爆发了两次重大疫情：一次是由家禽接触引起的，另一次是由新鲜蔬菜引起的。两次疫情都导致了1000多例病例，前一次疫情蔓延到49个州。11沙门氏菌在医院的爆发会导致严重的疾病和死亡。
Cedars-Sinai的异常沙门氏菌培养物取自两名接受外周干细胞采集术的患者。患者均为女性，年龄为65岁和45岁，分别有多发性骨髓瘤和再生障碍性贫血病史。两名患者在两个不同采集日的培养物均为D群沙门氏菌阳性，但这些培养物表现出不同的聚类和药物敏感性。后续的FT-IR分析在两个患者的样本中识别出不同亚种的肠道沙门氏菌，解释了前述现象。12 两位患者极不可能具有共同的感染源，也显然没有严重的沙门氏菌相关感染。
展望未来
凭借开创性的医学研究成果，定义医疗保健的教育计划和广泛的社区利益，Cedars-Sinai正为患者护理的质量和创新设立新的标准。继耳念珠菌和沙门氏菌的分型工作取得成功之后，Cedars-Sinai研究团队目前正在评估FT-IR识别脓肿分枝杆菌亚种的潜力。该信息可用于预测细菌的克拉霉素耐药性；因此，该技术应用的批准生效将有助于实现菌株实时分型，缩短获得克拉霉素最终药敏结果所需的时间。
驱动快速疾病检测和知情决策的创新仪器，将成为医疗机构有效分析和管理流行病的必要基础。新兴的挑战要求对现有工具进行评估，以应对未来医疗保健领域的挑战。
作者简介
Margie Morgan博士是Cedars-Sinai医学中心病理和检验医学科临床微生物学医学主任。Morgan博士负责微生物实验室的临床测试，指导55名员工执行诊断测试，为住院医生和同事提供教学服务，并参与微生物学新诊断技术的研究。
Deisy Contreras博士是Cedars-Sinai医学中心病理和检验医学科临床微生物实验室临床副主任。Contreras博士主要研究新诊断技术及其在临床实验室中的应用。
Markus Meyer博士是Bruker Daltonics公司(位于德国不来梅) 微生物与感染诊断(MID)部门卫生/流行病学事业部主管。他2010年加入Bruker Daltonics公司，担任各种生命科学质谱仪器的产品经理，之后于2018年加入微生物与感染诊断部门，担任全球耗材的产品经理。
参考文献
1 World Health Organization (WHO), Antimicrobial resistance, November 17th, 2021. Accessed April 2023. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance
2 Antimicrobial Resistance Collaborators, “Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis”, The Lancet, vol 399(10325) 629-655, January 19th, 2022.
3 Satoh K, et al., “Candida auris sp., a novel ascomycetous yeast isolated from the external ear canal of an inpatient in a Japanese hospital.” Microbiology and immunology, vol 53(1) 41–44, January 2009.
4 Lee W.G, et al, “First three reported cases of nosocomial fungemia caused by Candida auris”, Journal of clinical microbiology, vol 49(9) 3139–3142, June 29th, 2011.
5 Rhodes J, Fisher M.C, “Global epidemiology of emerging Candida auris”, current opinion in microbiology, vol 52 84–89, July 3rd, 2019.
6 County of Los Angeles Public Health, “Mitigating the Spread of Candida auris in Los Angeles Country”, July 2nd, 2022. Accessed April 2023. http://publichealth.lacounty.gov/acd/docs/MitigatingSpreadofC.aurisLAC.pdf
7 Schulthess B, et al, “Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory”, Journal of clinical microbiology, vol 52(8) 2797–2803, June 2013.
8 Contreras D.A, Morgan M.A, “Surveillance disgnostic algorithm using real-time PCR assay and strain typing method development to assist with the control of C.auris amid COVID-19 pandemic”, Frontier Cell Infection Microbiology, vol 12 887754, August 31st, 2022.
9 Faron M.L, et al, “Multicenter evaluation of the Bruker MALDI Biotyper CA system for the identification of clinical aerobic gram-negative bacterial isolates”, PLOS ONE, vol 10(11) e0141350, November 3rd, 2015.
10Popa G.L, Papa M.I, “Salmonella spp. Infection – a continuous threat worldwide”, Germs, vol 11(1) 88-96, March 15th, 2021.
11Phou S, et al, “Successful autologous hematopoietic stem cell transplants using salmonella positive products collected from asymptomatic donors”, Transfusion, vol 63(4) 861-866, March 7th, 2023.
12 Popa G.L, Papa M.I, “Salmonella spp. Infection – a continuous threat worldwide”, Germs, vol 11(1) 88-96, March 15th, 2021.
相关文章
更多 >