通过调节Ideonella sakaiensis菌株产生的PET降解酶的糖基化修饰详解
2024-10-24 来源:本站 点击次数:768聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是最常用的合成塑料之一[1]。由于耐用性、弹性、强度和耐化学腐蚀性均较高，被广泛应用于纺织、包装和包装瓶制造行业。但这些特性同时也使得PET很难被自然降解，大量使用及不当处理造成环境污染。自2005年以来，许多PET生物酶被发现，其中，大阪堺菌（Ideonella sakaiensis）产生的PET酶（IsPETase）对PET的降解效果良好，但它对温度非常敏感，37℃下24小时内就会大部分失活，因此需要对该酶进行改造以提高稳定性和活性，从而实现大规模、低成本地制造，从实验室转化到工业规模对PET进行降解。毕赤酵母是一种常用的工业生产外源性蛋白的菌种[2,3]，该表达体系会对蛋白产生丰富的糖基化修饰，从而提高产量，增加蛋白抗性。
湖北大学生命科学学院的马立新教授和翟超博士合作发表题为“Improving the activity and thermostability of PETase from Ideonella sakaiensis through modulating its post-translational glycan modification”的研究成果。本研究发现毕赤酵母的糖基化修饰使其成为IsPETase异源表达的优选宿主。由于丰富的N-link和O-link糖基化修饰，IsPETase的比活性和热稳定性显著提高。此外，在被Endo-β- nacetylglucosaminidase H (Endo H)切除部分N糖链后，IsPETase的比活性进一步增加。重要的是，部分去糖基化的IsPETase仍然保持较高的热稳定性，能够在50°C下，2至3天内完全降解未经处理的PET制品碎片。该研究中LC-MS/MS数据的N糖和O糖基化位点分析使用PEAKS® GlycanFinder完成。
重组IsPETase的产率随着目标基因拷贝数的增加而增加
构建IsPETase基因拷贝为1~4的重组毕赤酵母GS115菌株（GS115-IP-1、GS115-IP-2、GS115-IP-3、GS115-IP-4），进行摇瓶发酵。诱导5d后，重组蛋白的产率分别达到0.13、0.25、0.48和0.60 mg/mL，表明重组IsPETase（IsPETasePp）的表达量随基因拷贝数的增加而增加。发酵上清液的SDS-PAGE显示，诱导5天后，检测到部分条带（Fig. S1a），糖蛋白染色结果证实了毕赤酵母对目标蛋白的糖基化修饰(Fig. S1b)。用自制Endo H去除IsPETasePp的多糖链后，观察到明显的条带，证明切糖成功(Fig. S1c)，糖蛋白染色也证明了这点 (Fig. S1d)。
Fig. S1 发酵上清液蛋白胶图
部分脱糖IsPETase-Pp的特性
经测定，部分脱糖的IsPETase-Pp的最适温度为50℃(Fig.1a)，高于先前的文献报道[4]。此外，与之前的报道相比，部分脱糖IsPETase-Pp的热稳定性更高，在50℃下孵育2小时后，其活性仍保持在90%左右。在60°C和70°C时，活性急剧下降，在2小时后活性不到20% (Fig.1b)。
Fig. 1 IsPETase-Pp热稳定性测定
高密度发酵制备IsPETase酶
摇瓶发酵的原料和培养条件与工业化的大规模发酵完全不同，且有报道指出高密度表达会使宿主细胞分泌蛋白时发生应激反应，导致重组蛋白在内质网或高尔基复合体中停留时间延长，从而使得多糖链更长，抑制IsPETase-Pp的催化活性。为探究IsPETase-Pp在工业条件下的糖基化修饰情况，以GS115-IP-4为例，采用高密度发酵制备IsPETase-Pp。与摇瓶发酵相比，Is PETase-Pp的表达量明显提高，5天后达最大值，产量约为1.20 g/L。糖基化染色结果表明目标蛋白的糖基化程度比较高（Fig. 2a、b）。经Endo H处理后，观察到3个主要条带（Fig. 2c、d）。下方两个条带为IsPETase-Pp，上方一条带为毕赤酵母dihydrolipoyl Dehydrogenase。
Fig. 2 高密度发酵表达的脱糖IsPETase
部分脱糖IsPETase-Pp的催化活性和热稳定性
设定不同的Endo H实验条件，观察处理后的Is PETase-Pp催化活性，结果如Fig. 3a。可以看出，发酵上清液几乎没有任何活性，因为培养基中的金属离子，尤其是Fe3+会显著抑制酶的催化活性。用10 kDa超滤膜过滤上清液后，酶活性明显提高。并且无论是超滤前还是超滤后用Endo H处理样品，酶活性均显著提高。此外，用PNGase F酶切除完整N糖链后的酶活性有所提高，但比Endo H处理后的活性低一些。然后，作者探索了Endo H的处理时间，结果表明用667 nM Endo H处理0.5 h后可以保持较高的初始活性（Fig. 3b）。
Fig. 3 IsPETase-Pp脱糖条件优化
接下来，作者研究了部分脱糖IsPETase-Pp在40℃、45℃和50℃的热稳定性。结果表明，该酶在40℃下非常稳定，12小时后完全保持活性。在45℃下12小时后保持约60％的活性。在50℃下，酶在6小时后仍保留40％以上的活性（Fig. 4a）。而先前报道的IsPETase-Ec[5]在同样条件下1h内几乎全部失活，SDS-PAGE结果一致（Fig. 4b）。进一步的动力学实验发现部分脱糖IsPETase-Pp的绝大部分降解产物为TPA。
Fig. 4 部分脱糖IsPETase-Pp的热稳定性
IsPETase-Pp的糖基化修饰分析
IsPETase有8个潜在的N糖基化位点，且位点基本分布在蛋白表面，作者通过LC-MS/MS在这8个位点上均鉴定到了糖基化修饰。其中，N114、N138、N212、N264和N288位点信号较高，N190、N205和N277的信号较弱(N代表Asn)。值得注意的是，N205后面的Asp206属于IsPETase的催化三元体。由于N205信号较弱，推断糖基化对水解中心的影响很小，这意味着糖基化通过屏蔽酶分子而不是阻断催化位点来抑制酶的催化活性。此外，还发现了19个潜在的O糖基化位点，与N糖相比，O糖相对较短，糖基化蛋白的比例更低，因此屏蔽作用要弱得多，这也解释了为什么Endo H处理足以恢复蛋白质的活性。
IsPETase有8个潜在的N糖基化位点，且位点基本分布在蛋白表面，作者通过LC-MS/MS在这8个位点上均鉴定到了糖基化修饰。其中，N114、N138、N212、N264和N288位点信号较高，N190、N205和N277的信号较弱(N代表Asn)。值得注意的是，N205后面的Asp206属于IsPETase的催化三元体。由于N205信号较弱，推断糖基化对水解中心的影响很小，这意味着糖基化通过屏蔽酶分子而不是阻断催化位点来抑制酶的催化活性。此外，还发现了19个潜在的O糖基化位点，与N糖相比，O糖相对较短，糖基化蛋白的比例更低，因此屏蔽作用要弱得多，这也解释了为什么Endo H处理足以恢复蛋白质的活性。
Fig. S10 N277位点的糖基化修饰谱
Fast-PETase在毕赤酵母GS115中的表达
近期一种热稳定性和活性更高的IsPETase突变蛋白Fast-PETase被合成出来[6]。作者测试了该变体的制备策略。在Fast-PETase中，糖基化位点和突变位点之间没有重叠，SDS-PAGE结果表明Fast-PETase-Pp在摇瓶和高密度发酵过程中也被大量糖基化(Fig. 5a)。在Endo H处理后活性也显著提高(Fig. 5b)。此外，部分脱糖Fast-PETase-Pp具有较高的热稳定性。在50℃、55℃和60℃下孵育12 h后，催化活性分别保持在80%、70%和60%以上。在65°C时，其热稳定性急剧下降，12小时后仅保留10%的活性。在70°C时，3小时内全部失去活性(Fig. 5c)。
Fig. 5 高密度发酵制备Fast-PETase-Pp
未处理的PET用品降解测试
随机购买白色和黑色PET托盘制品各一份，使用重组IsPETase和Fast-PETase分别进行降解测试。部分脱糖IsPETase-Pp在2天内降解了黑色托盘薄片（图 6a）。HPLC结果显示PET几乎以线性速度被降解(Fig. 6b)。而部分脱糖Fast-PETase-Pp的降解速度更快，在2d内，补酶一次可使PET薄片完全降解。此外，部分脱糖Fast-PETase-Pp在50°C下，3天内即可完全降解5.4 g黑色PET托盘(Fig. 6c)。但对PET水瓶的降解能力不明显。
Fig. 6 PET薄片制品的降解测试
小结
作者探索了高密度发酵制备的IsPETase-Pp的实验条件，并利用Endo H对IsPETase-Pp进行部分切糖处理，以提高酶的热稳定性和活性。为大规模制备IsPETase-Pp及其蛋白变体提供了参考依据，也为推动PET生物降解从实验室走向工业化奠定了基础。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s42003-023-04413-0#Sec29
原文链接：https://www.nature.com/articles/s42003-023-04413-0#Sec29
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参考文献
1.Magalhães, R. P., Cunha, J. M. & Sousa, S. F. Perspectives on the Role of Enzymatic Biocatalysis for the Degradation of Plastic PET. Int. J. Mol. Sci. 22, 2011257 (2021).
2.Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C. & Cregg, J. M. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris. Curr. Opin. Biotechnol. 13, 329–332 (2002).
3. Cereghino, G. P. & Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 10, 422–427 (1999).
4. Yoshida, S. et al. A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate). Science 351, 1196–1199 (2016).
5. Wang, F. et al. High-level expression of endo-β-N-acetylglucosaminidase H from Streptomyces plicatus in Pichia pastoris and its application for the deglycosylation of glycoproteins. PLoS One 10, e0120458 (2015).
6. Lu, H. et al. Machine learning-aided engineering of hydrolases for PET depolymerization. Nature 604, 662–667 (2022).
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