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研究进展:偏振荧光显微成像技术的发展及应用

2024-12-25     来源:本站     点击次数:496

荧光显微技术在生命科学、医学研究和药物开发等领域广泛应用,可对生命活动进行细胞和亚细胞水平观测。其基本原理是利用荧光探针标记生物体内特定结构,通过探测荧光信号获取相关信息。荧光的基本物理指标包括强度、波长、时间和偏振等,其中对荧光偏振信息的利用及新型偏振荧光显微成像技术的研发受到越来越多关注。自20世纪50年代以来,偏振荧光显微技术不断发展,涵盖多种偏振调制技术和成像系统,其相关应用拓展到细胞和亚细胞尺度,涉及多种生物结构和生物体。

浙江大学光电科学与工程学院极端光学技术与仪器全国重点实验室魏明哲团队从偏振荧光成像原理出发,对目前存在的多种偏振荧光显微成像技术进行原理介绍和现状分析,列举了其在生物医学领域的相关应用,讨论了其发展趋势及前景,旨在为该领域的科研人员了解偏振荧光显微成像技术提供参考。

偏振荧光成像原理
一、荧光的偏振特性
荧光物体吸收和辐射通常被视为各向同性,但实际采用偶极子或更高阶模型对荧光偏振特性建模更准确。从经典物理学角度,荧光偶极子吸收过程的吸收率与激发光和吸收偶极矩夹角余弦值平方成正比,辐射电场与光传播方向和辐射偶极矩有关,这体现了荧光吸收和辐射过程中能量分布不均一的偏振特性。

二、偏振成像调制方法
最初依据荧光辐射过程中的偏振特性(荧光各向异性),通过测量荧光偏振系数或各向异性系数来定量分析生物大分子取向信息及动态变化,但荧光分子旋转和荧光共振能量转移会导致去极化现象,影响测量。后来提出荧光线性二向色性偏振显微成像技术,利用荧光吸收过程中分子对偏振光方向的选择性来避免去极化影响,通过测定不同方向线偏振激发光对应的荧光辐射强度之比测定生物样本中偶极子取向信息及其动态变化。

三、偏振成像的空间-角度表征理论
荧光各向异性和线性二向色性偏振显微成像技术在测量生物分子取向分布方面有一定应用,但存在局限性,无法获得整幅图像中完整取向顺序信息。2019年Chandler等提出空间-角度荧光显微镜基本理论,从希尔伯特空间出发对消球差透镜建模,推导出成像模型,并采用球谐基对偶极子空间-角度成像模型进行描述,实现了从偶极子取向二维平面解析到三维空间解析的跨越,对偏振显微成像系统发展意义重大。

基于偏振调制的荧光显微成像技术
一、宽场偏振荧光显微技术
基于荧光线性二向色性的偏振显微成像技术最早出现在宽场荧光显微镜中。2006年Vrabioiu等用其研究活酵母菌隔膜蛋白结构;2011年DeMay等提出相关成像系统并用于测量绿色荧光蛋白偶极矩取向;2015年Abrahamsson等开发的MF-PolScope可实现多个偏振态和多达25个焦平面的同时成像,获取瞬时三维图像。

二、共聚焦偏振荧光显微技术
共聚焦荧光显微技术与偏振调制结合可更好地探测偶极子取向。2003年Bigelow等设计了可用于荧光各向异性成像的激光扫描共聚焦荧光成像系统;2013年Kress等提出共聚焦偏振荧光显微技术,能量化细胞膜分子取向顺序;Wang等后续改进提高了采集速率,相关技术在巨型单层囊泡和COS-7细胞上得到验证。

三、光片偏振荧光显微技术
光片荧光显微镜具有独特优势,光毒性和光漂白效应小,轴向分辨率高且可三维快速成像。2018年Markwardt等首次将偏振荧光成像应用于光片显微技术,用于观测活体线虫胚胎;后提出双视角倒置偏振光片荧光显微技术,实现荧光分子三维空间强度和三维分子取向联合重构,但存在噪声抑制相关问题,浙江大学课题组提出改进方法,解决了现有方法的诸多问题。

四、双光子偏振荧光显微技术
2007年马辉课题组利用荧光各向异性表征生物分子旋转动力学和相互作用;2009年Gasecka等提出偏振双光子显微技术,可定量测量脂质和细胞膜中局部静态分子取向,具有诸多优势;Lazar等发现双光子偏振荧光显微镜检测灵敏度更高;Ferrand等从数学上证明了取向测量所需偏振测量次数,并提出相关数据处理方法完善了理论。

五、宽场超分辨分子取向显微技术
偏振荧光显微镜受衍射极限影响,北京大学席鹏研究团队研发多种技术解决。2016年的SDOM技术可解析亚衍射极限体积内偶极子有效取向;2019年的pSIM技术将偏振激发看作结构化照明,提升了分辨能力;2023年提出的新型高速自偏振同步调制3DSIM系统和三维取向映射显微技术,分别实现了三维高速超分辨成像和高时空分辨率下荧光偶极子三维取向测量。

六、单分子取向定位显微技术
偏振调制用于单分子定位显微镜,早期通过激发光偏振变化激发分子线性二向色性进行单分子二维取向估计,后引入多个照明角度估计三维方向,还可通过探测端偏振分裂获取分子取向信息,但方向估计需校准光学像差。2023年Zhang等开发的raMVR显微镜结合偏振探测和光瞳分裂技术,实现了单分子精度的六维成像,具有出色性能。

七、基于偏振调制的分辨率增强显微技术
偏振可提升空间分辨率。2014年Hafi等提出SPoD技术,通过旋转线偏振光激发和相关算法处理,提升了空间分辨率;2018年Zheng等开发P-TIRF显微技术,通过偏振调制器实现快速偏振调制,提升了三维样品结构重建精度;此外,利用衍射图案对荧光团方向和位置的依赖性也可提高空间检测精度,如Lew等研究发现偏振成像可抑制偶极子径向偏振光,提高定位精度。

生物医学应用
一、膜类结构观测
早期利用偏振荧光显微镜测量生物分子转动特征,如1990年Florine-Casteel成像单层囊泡测量脂质顺序;羰花青染料常用于标记膜类结构,1979年Axelord研究其在红细胞膜中的取向;1990年Dix等测量细胞细胞质粘度;2013年Wang等测量COS-7细胞细胞膜结构;2023年Zhang等研究淀粉样蛋白-脂质相互作用,对研究神经退行性疾病发病机制意义重大。

二、蛋白质类结构观测
隔膜蛋白具有荧光偏振特性,2006年Vrabioiu等用宽场偏振荧光显微镜观察活酵母隔膜蛋白,解决结构争议;2011年DeMay等确定其在活细胞中的组织情况;2015年Abrahamsson等揭示芽殖酵母细胞分裂中的蛋白质组装过程;2016年席鹏课题组实现活酵母细胞中隔膜蛋白和核孔复合蛋白的超分辨偶极子成像。肌动蛋白参与众多细胞生命过程,2012年Vishwasrao等研发相关成像方法,2016年和2023年席鹏课题组分别实现其超分辨偶极子取向测量和精确测量分子结构。微管在细胞中起重要作用,2023年席鹏课题组发现其新结构特征,表明其与肌动蛋白和肌球蛋白协同作用促进膜管化。

三、其他生物医学应用
荧光偏振可用于药理学筛选测定,测量药物-蛋白质或蛋白质- 蛋白质相互作用。Dubach等使用多光子荧光各向异性显微镜实现细胞和亚细胞尺度下活体实时体内药物分布和相互作用测量,2014年首次实现靶标结合与未结合小分子药物实时可视化;2016年Vinegoni等开发相关显微镜,在体外和小鼠肿瘤体内具有高分辨率和深穿透能力,对新型药物开发有重要指导意义。

总结与展望
偏振荧光显微技术作为一种强大的成像工具,与传统荧光显微技术专注于荧光分子的位置和浓度信息不同,它能够额外获取生物分子的结构取向信息,这一特性使其在生物医学研究领域中占据着独特且重要的地位。在单分子结构研究中,它有助于深入了解分子层面的微观结构和相互作用;在蛋白质结构研究方面,能够为解析蛋白质的组装、功能发挥机制提供关键线索;对于生物细胞膜结构的研究,更是可以揭示细胞膜的组成、动态变化以及与周围环境的相互作用等奥秘。

然而,现有的偏振荧光显微技术仍面临诸多挑战与局限。在分子三维取向观测方面,尽管已经取得了一定进展,如通过单分子取向成像和光片显微成像技术在分子三维取向成像上有所突破,但目前大多数基于二维平面的分子取向观测方法仍难以避免偏差。全面且精确的分子三维取向观测,迫切需要更为优化的偏振调制设计,以及在成像模型和图像重构理论方面的创新。

尽管面临诸多挑战,但偏振荧光显微技术的发展前景依然广阔。随着科技的不断进步,有望在理论研究、技术创新和实际应用等多个方面取得突破,为生物医学研究带来更多的惊喜与发现,进一步推动该领域向更深层次、更精准化方向发展,从而为揭示生命活动的本质和疾病的发病机制提供更有力的支持,也为新型药物研发、精准医疗等应用领域开辟新的道路。

声明:本文仅用作学术目的。文章来源于:魏明哲, 刘钧宇, 郭敏, 刘华锋. 偏振荧光显微成像技术及研究进展(特邀)[J]. 激光与光电子学进展, 2024, 61(6): 0618011. 

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