在人类与疾病斗争的漫长历史中，脑瘤始终是一块难啃的 “硬骨头”。其中，胶质母细胞瘤（GBM）作为一种极为凶险的脑部肿瘤，严重威胁着患者的生命，给无数家庭带来了沉重的负担。尽管现代医学在诸多领域取得了长足进步，但胶质母细胞瘤的高侵袭性和复杂性，使其治疗成为医学领域的重大挑战。

VU大学研究团队发表于《Angiogenesis》的“Optical clearing and fluorescence deep-tissue imaging for 3D quantitative analysis of the brain tumor microenvironment”研究文章，提出了脑部肿瘤组织的整体组织透明、3D成像和3D空间定量统计分析的工作流程，为脑部肿瘤研究带来了全新的思路和方法。

研究背景
1、胶质母细胞瘤的挑战
GBM是一种极具侵袭性的脑部肿瘤，其难治性部分归因于肿瘤细胞广泛而弥漫地浸润周围微环境。这种浸润改变了脑内的微血管结构、组织灌注以及大脑整体架构，导致肿瘤与微环境之间的关系错综复杂。深入理解GBM细胞在空间上的异质性及其与微血管、血管间组织微环境的相互关系，对于攻克这一疾病至关重要，而这迫切需要更先进的三维分析技术来研究脑部肿瘤组织。

2、现有成像技术的局限
在脑部肿瘤研究中，光学3D分析技术虽然有望在细胞分辨率下对脑结构成像，成为连接CT、PET、MRI与传统显微组织学和免疫组织化学的桥梁，但传统的活体共聚焦显微镜技术却存在诸多不足。动物的镇静时间、有限的成像深度、狭小的视野以及荧光标记相关的限制等因素，都制约了其在深入研究中的应用。尽管如此，体外光学成像技术的出现为研究提供了新的方向，其不受活体成像中部分因素的限制，为更精准地研究脑部肿瘤微环境带来了可能。

3、光学切片技术的兴起
长期以来，3D结构的光学成像依赖于组织切片技术，但这一过程需要获取并精确对齐大量组织切片，操作极为繁琐且容易出错。随着技术的发展，光学切片技术应运而生，该技术通过透明组织使其“光学穿透”，从而实现深层组织的荧光激发和检测。同时，多光子显微镜和光片显微镜等设备的改进，以及ImageJ、Amira和Imaris等软件工具的开发，也为光学切片技术的广泛应用奠定了基础。

研究方法
1、动物实验准备
动物模型建立、活体成像操作及光声成像评估。

2、整体组织透明与标记方法
CLARITY和iDISCO两种整体组织透明方法。

3、图像采集与处理
使用多种显微镜进行图像采集，利用FIJI软件对双光子图像进行重建分析。

与其他方法的比较
1、活体成像的深度限制
研究人员通过在小鼠颅骨上应用颅窗并利用双光子成像技术，对小鼠脑微血管进行了活体成像研究。实验发现，尽管通过该窗口能够清晰识别用于定位的浅表血管，但成像深度却十分有限，最大仅能达到200μm。这一深度远远不足以深入研究脑内相关区域，因此促使研究团队寻求更有效的体外成像方法，以更好地观察和量化肿瘤细胞与脑微环境之间的关系，特别是聚焦于脑部肿瘤血管系统。

2、体外成像的显著优势
为了实现对整个小鼠脑区域的微观可视化，研究采用了CLARITY和iDISCO两种整体组织透明方法对小鼠脑组织进行处理。CLARITY方法使组织尺寸扩张约1.5倍，而iDISCO方法则导致组织直径稳定收缩约1.2倍。在对经CLARITY处理后的顶叶皮质区域进行研究时发现，通过双光子显微镜查看微血管，能够在2000μm的深度下清晰成像，并且与活体成像中随着深度增加信号迅速衰减不同，整体组织透明组织中的荧光信号强度在整个2000μm的工作距离内都能保持在表面信号强度的65%以上。因此，体外成像技术在深度和信号强度保持方面具有显著优势。

3、健康脑组织血管的量化分析
利用健康小鼠脑组织，研究团队开发了一种用于量化血管系统的工作流程。通过对染色的血管进行计算建模，发现小脑不同区域（如颗粒层和分子层）的血管在数量、长度、表面积、直径和体积等方面存在显著差异。这一结果不仅证实了之前关于不同脑区血管差异的研究发现，也进一步强调了在研究细胞与脑微环境的空间关系时，选择解剖学上明确且相同的区域进行比较的重要性。

4、肿瘤细胞与血管的关系剖析
★ 血管染色稳定性
为了探究肿瘤细胞是否影响血管内皮糖萼，研究人员通过原位异种移植人类细胞构建了脑部肿瘤模型。肿瘤生长并未显著改变对脑微血管的染色模式，这意味着在肿瘤存在的情况下，仍可可靠地标记脑微血管。

★ GBM血管变化建模
运用iDISCO方法对固定不同时长的异种移植脑部肿瘤组织进行整体组织透明处理后，研究人员发现肿瘤核心区域的血管分支数量、总长度和表面积均有所增加，而平均血管直径相较于对侧相应区域略低，但最终导致肿瘤核心与对侧区域的血管体积相当。这一变化反映了肿瘤微环境对血管系统的重塑作用，为深入理解肿瘤血管生成机制提供了重要依据。

★ GBM细胞分布特征
通过对GBM细胞在肿瘤核心、深部灰质和白质等不同解剖区域的分布进行量化分析，研究发现肿瘤核心区域的细胞密度显著高于浸润前沿区域。同时，计算肿瘤细胞与微血管之间的距离发现，在肿瘤核心区域，部分肿瘤细胞距离微血管较远，而在深部灰质的浸润前沿，肿瘤细胞更倾向于靠近微血管分布，这可能暗示了GBM细胞在深部灰质区域的迁移与血管密切相关，或者是肿瘤核心区域细胞增殖导致血管间距离增大。此外，研究还观察到部分肿瘤细胞通过细胞突起相互连接形成类似多细胞网络的结构，这一发现与之前的研究结果相符，进一步揭示了GBM细胞在脑内的复杂分布模式和相互作用方式。

研究结论
1、技术创新的价值
通过CLARITY和iDISCO等整体组织透明方法，研究人员能够制备出透明的脑组织样本，从而实现对脑微血管架构以及肿瘤细胞在脑部肿瘤微环境中分布的三维可视化研究。这种创新技术克服了传统成像方法在深度和分辨率上的局限性，为深入研究脑部肿瘤微环境中的细胞与血管关系提供了有力工具。

2、揭示肿瘤细胞分布规律
研究结果详细揭示了GBM细胞在脑内不同区域的分布差异，包括肿瘤核心与浸润前沿、灰质与白质区域之间的细胞密度和与微血管距离的变化。这些发现有助于深入理解GBM细胞的迁移模式，如在灰质区域肿瘤细胞倾向于沿血管迁移，而在白质区域细胞迁移可能涉及多种途径，包括沿着白质纤维束迁移等。此外，肿瘤细胞之间形成的网络结构也为研究肿瘤细胞间通讯和集体行为提供了新的视角。

3、开辟研究新路径
通过结合整体组织透明技术、荧光深层组织成像和3D空间定量统计分析方法，能够更全面、精确地研究脑部肿瘤细胞与微环境之间的相互作用，这将有助于发现新的治疗靶点和开发更有效的治疗策略，为未来脑部肿瘤治疗带来新的希望。

展望未来
在抗体染色方面，虽然已注意到某些抗体需要优化，但未来还需更系统地探索不同抗体在大组织染色中的最佳条件，包括抗体浓度滴定、组织预处理方法等，以提高染色效果和特异性。此外，还可进一步探索其他具有特异性结合能力的分子探针，以实现对脑部肿瘤微环境中更多细胞类型和分子标记的可视化研究。

在未来研究中，应更加关注这些技术在临床转化方面的潜力，且脑部肿瘤研究涉及多个学科领域，如神经科学、肿瘤学、生物医学工程和影像学等。未来需要进一步加强多学科之间的合作与融合，整合不同学科的理论和技术优势。例如，结合神经科学对脑功能和神经回路的理解，以及生物医学工程在新型成像设备和材料开发方面的创新，推动脑部肿瘤研究在基础机制探索和临床应用方面取得更大突破。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：Lagerweij, T., Dusoswa, S.A., Negrean, A. et al. Optical clearing and fluorescence deep-tissue imaging for 3D quantitative analysis of the brain tumor microenvironment. Angiogenesis 20, 533–546 (2017). https://doi.org/10.1007/s10456-017-9565-6.