聚合酶链式PCR反应体系各组份对实验的影响
2025-01-07 来源:本站 点击次数:449
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
PCR反应体系由反应缓冲液（PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）、耐热DNA聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成，各个组份对PCR结果至关重要。
1. 反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶试剂盒供应。
标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响；浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200 μM时，Mg2+为1.5 mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度，在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好（仅供参考）。
2. dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400 μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于 其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。
3. Taq DNA聚合酶：在100μL反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对 PCR 反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μL或 50 μL），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。
4. 引物：引物是扩增PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
（1）引物的长度以15-30 bp为宜，通常设计长度为17-25bp；GC含量在40-60%（最好在45-55%）；两条引物的Tm值应尽量接近，可以采用专用软件来计算（Primer Premier 5）；尽量避免A/G或T/C的连续排列，局部避免GC rich或AT rich（特别是3’端），碱基的分布应表现出是随机的。
（2）互补性，引物内部或两条引物之间避免3个碱基以上的互补序列，引物末端避免2base以上的互补序列。引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基（最好是G或C，避免为T）在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。
（3）引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μL较好。
（4）引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100 μM），保存于-20 ℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10 μM或20 μM的工作液。
5．模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR模板。虽然 PCR 可以微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为模板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或 拷贝数较高的待扩增片段作为起始模板。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白，将可能干扰PCR反应。
6. PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。
注意事项：
1.PCR应该在没有DNA污染的干净环境中进行，最好设立一个专用的PCR配制室、模板室、扩增室，避免污染（16S）。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，操作过程中均应戴手套。
4.PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高温高压灭菌。
5.试剂都应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性与平行性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用灭菌的tubes和tips，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.PCR配制试剂应在冰上融化，并且要瞬离并充分混匀。
PCR反应体系由反应缓冲液（PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）、耐热DNA聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成，各个组份对PCR结果至关重要。
1. 反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶试剂盒供应。
标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响；浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200 μM时，Mg2+为1.5 mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度，在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好（仅供参考）。
2. dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400 μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于 其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。
3. Taq DNA聚合酶：在100μL反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对 PCR 反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μL或 50 μL），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。
4. 引物：引物是扩增PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
（1）引物的长度以15-30 bp为宜，通常设计长度为17-25bp；GC含量在40-60%（最好在45-55%）；两条引物的Tm值应尽量接近，可以采用专用软件来计算（Primer Premier 5）；尽量避免A/G或T/C的连续排列，局部避免GC rich或AT rich（特别是3’端），碱基的分布应表现出是随机的。
（2）互补性，引物内部或两条引物之间避免3个碱基以上的互补序列，引物末端避免2base以上的互补序列。引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基（最好是G或C，避免为T）在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。
（3）引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μL较好。
（4）引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100 μM），保存于-20 ℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10 μM或20 μM的工作液。
5．模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR模板。虽然 PCR 可以微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为模板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或 拷贝数较高的待扩增片段作为起始模板。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白，将可能干扰PCR反应。
6. PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。
注意事项：
1.PCR应该在没有DNA污染的干净环境中进行，最好设立一个专用的PCR配制室、模板室、扩增室，避免污染（16S）。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，操作过程中均应戴手套。
4.PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高温高压灭菌。
5.试剂都应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性与平行性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用灭菌的tubes和tips，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.PCR配制试剂应在冰上融化，并且要瞬离并充分混匀。
相关文章
更多 >