GDF15 Modulates the Zoledronic-Acid-Induced Hyperinflammatory Mechanoresponse of Periodontal Ligament Fibroblasts

Keywords: DNA damage response; GDF15; inflammatory mechanoresponse; orthodontic tooth movement; periodontal ligament fibroblasts; senescence; zoledronic acid.

在正畸牙齿移动（OTM）期间，通过正畸矫治器施加机械力来促进牙周膜（PdL）重塑和牙槽骨的生理适应。这些力触发 PdL 细胞的机械生物学反应，促进局部无菌和短暂的炎症微环境，从而导致组织和骨骼重塑。因此，压缩力通常通过诱导缺氧和激活牙周膜成纤维细胞（PdLFs）的促炎反应来促进骨吸收，包括增加细胞因子，如白细胞介素1β（IL-1β）、IL6、IL8 和环氧合酶2（COX2）。

生长/分化因子15（GDF15）是 TGF-β/BMP 超家族的成员，在代谢、机械或化学应激期间由各种细胞类型和组织释放，在 OTM 中也起主要作用。GDF15 可在被机械刺激的人牙周膜成纤维细胞（hPdLFs）中上调，并促进其促炎反应。除了调节 PdL 中成骨细胞分化和炎症外，GDF15 还参与细胞死亡和细胞衰老以及衰老的调控。

OTM 可受到多种药物的干扰，这些药物也可能诱发影响骨吸收或附着过程的功能障碍。其中一种药物是双膦酸盐类（BP）唑来膦酸（ZOL），主要用于治疗癌性骨转移、骨代谢疾病以及骨质疏松症。已有研究描述了ZOL 对几种细胞类型细胞活力和增殖能力的影响，尤其是破骨细胞，其对DNA损伤反应和衰老诱导的影响也在几种细胞类型中得到阐释。然而，OTM 期间 ZOL 对 PdLFs 机械相关功能的确切影响尚未得到充分研究。

因此，德国耶拿大学附属医院口腔正畸科、保守牙科和牙周病学系老年牙科课题组的一项研究旨在表征 ZOL 对人牙周膜成纤维细胞调节的炎症机械反应的作用，并进一步确定 GDF15 的潜在影响。研究成果发表在 CELLS 期刊题为“GDF15 Modulates the Zoledronic-Acid-Induced Hyperinflammatory Mechanoresponse of Periodontal Ligament Fibroblasts”。

首先，评估了 hPdLFs 暴露于不同浓度 ZOL（0.5 μM、5 μM、50 μM）的反应。MTT测定分析表明，与对照组相比，在为期两天 ZOL 处理的 hPdLFs 中检测到代谢活性水平降低（图1 a），且最高的 ZOL 浓度导致最低的代谢活性。进一步对hPdLFs 进行台盼蓝染色（图1 b），发现随着 ZOL 浓度的增加，观察到更多的台盼蓝-阳性细胞，表明 ZOL 具有细胞毒作用。增殖标志物 Ki67 免疫荧光染色显示，随着 ZOL 浓度的增加，增殖成纤维细胞的数量减少，表明 ZOL 对 hPdLFs 细胞增殖具有限制作用（图1 c、d）。

由于特定刺激会触发 PdL 成纤维细胞向成骨细胞分化，因此，研究了 ZOL 对其细胞命运的影响。对成骨标志基因 ALP 和 RUNX2 进行定量表达分析（图1 e、f），发现ZOL 处理 48 小时后未检测到基因转录的显著差异。此外，检测了反映成骨细胞活性的 ALP 活性水平（图1 g、h），与成骨标志物的表达水平一致，ZOL 暴露后也未观察到钙沉积的显著变化。这些数据表明，唑来膦酸剂量依赖性地限制了 PdL 成纤维细胞的活力和增殖，而不会影响这些细胞的成骨分化。

图1 唑来膦酸限制了人 PdL 成纤维细胞的细胞活力和增殖。

鉴于唑来膦酸对不同细胞类型中 DNA 损伤反应（DDR）的影响以及这种应激反应在 PdL 健康和功能中的相关作用存在相互矛盾的结果，因此，接下来专注 ZOL 处理的 hPdLFs 中的 DDR 激活。

TUNEL法（断裂DNA 分析）检测 ZOL 处理引起的 DNA 链断裂，揭示了 DNA 损伤的剂量依赖性增加。磷酸化的 H2A.X 是 DDR 激活的标志，免疫荧光染色显示，ZOL 导致 hPdLFs 中 H2A.X 的磷酸化速率以剂量依赖性方式升高，这表明 hPdLFs 中的 DDR 激活增强。

DDR 信号的持续激活可能会触发细胞衰老，损害 hPdLFs 的功能。为了验证这一点，对衰老相关细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂 p21WAF1/CIP1/SDI1进行了免疫荧光染色。由于 ZOL 暴露，在 hPdLFs 中检测到 p21 强度的剂量依赖性增加（图2 a、b），表明向衰老细胞命运的转变。进一步分析衰老相关标志物 β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性，证实了 ZOL 处理的 hPdLFs 的衰老增加（图2 c、d）。此外，检测到衰老相关细胞因子如 IL6、IL8 和 COX2 的表达增加，以及 GDF15 表达的增加（图2 e）。

这些数据表明，唑来膦酸通过诱导 DNA 链断裂来诱导相关的应激反应，这可能导致细胞存活率降低并促进 hPdLFs 的细胞衰老。图2 ZOL 处理促进 hPdLFs 的细胞衰老。

向衰老表型的转变可能会显著影响 hPdLFs 的功能，这可能与在正畸牙齿移动过程中组织和骨骼重塑相关。因此，研究人员旨在研究 ZOL（5 μM）对 hPdLFs 机械反应的影响，更具体地关注促炎过程的诱导和 OCs 的激活。

在施加 24 小时的压缩力（2 g/cm2）后，确定 ZOL 处理的 hPdLFs 的炎症机械反应谱的差异，对编码力调节的细胞因子的基因进行定量表达分析（图3 a）。施加压缩力后，检测到所有分析基因（IL1B、IL6、IL8、COX2 和 GDF15）的表达水平增加（图3 a）。虽然 IL8 和 COX2 没有显示 ZOL 依赖性变化，但 IL1B、IL6 和 GDF15 水平显著增强，表明与 ZOL 相关的特异性促炎特征增强（图3 a）。

为了从功能上检查机械刺激的 ZOL 暴露的成纤维细胞的炎症反应，进一步研究了免疫细胞的激活（图3 b、c）。在与刺激的 hPdLFs 共培养实验中，当感应到促炎信号时，非贴壁单核细胞 THP1 细胞分化为贴壁巨噬细胞。因此，在压缩刺激的 ZOL 处理的 hPdLFs中，贴壁 THP1 细胞的数量显著增加，证实了暴露于唑来膦酸的 PdL 成纤维细胞的高炎性机械反应。

由于 GDF15 在调节 hPdLFs 对压缩刺激的促炎反应中有重要功能，最后，研究了其在压缩力下 ZOL 处理的 hPdLFs 过度炎症反应中的潜在作用。在ZOL 处理后，压缩力刺激前使用 siRNA 介导的基因沉默敲低 GDF15，发现其RNA（图3 d）、蛋白质（图3 e、f） 和分泌（图3 g）表达降低。在 GDF15 缺失的情况下，压缩力刺激的 hPdLFs 中，ZOL 诱导的 IL1B 和 IL6 表达增加被减弱（图3 d）。此外，在 GDF15 缺失的 hPdLFs 中，ZOL 依赖性的免疫细胞活化上调被降低（图3 h、i），这特别表明了 GDF15 在响应 ZOL 治疗中具有深远的促炎作用。

这些数据表明，ZOL 改变的细胞特征确实会干扰 hPdLFs 的生物力学功能，并且 GDF15 在此过程中起着至关重要的作用。图3 ZOL 诱导了部分受 GDF15 调节的高炎症机械反应。

总之，该研究表明，唑来膦酸钠可以通过直接抑制骨吸收细胞来抑制牙齿移动，通过影响牙周膜成纤维细胞的细胞特性和机械生物学功能来间接影响它们的激活。研究证明了唑来膦酸特异性触发 DNA 损伤和细胞衰老，潜在性的触发过度炎症机械反应，降低破骨细胞活化。然而，这可能会在双膦酸盐患者的正畸治疗中引发潜在的负面作用。GDF15 作为促进这些 ZOL 相关变化的潜在调节因子，将是未来OTM患者特异性治疗策略的可能靶点。

参考文献：Nitzsche A, Hennig CL, von Brandenstein K, Döding A, Schulze-Späte U, Symmank J, Jacobs C. GDF15 Modulates the Zoledronic-Acid-Induced Hyperinflammatory Mechanoresponse of Periodontal Ligament Fibroblasts. Cells. 2024 Jan 12;13(2):147. doi: 10.3390/cells13020147. PMID: 38247838; PMCID: PMC10814077.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38247838/

Impact Factor: 5.1 (2023); 5-Year Impact Factor: 6.0 (2023)

ISSN: 2073-4409

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