荧光标记的超分辨显微成像技术，以其高分辨率、特异性强、可实时动态观察等优点，成为了探索生物医学现象和作用机制的重要工具。然而，固定、染色等处理过程不仅繁琐，还可能对样品的生物结构与活性产生干扰。与此同时，无标记显微成像技术因能避免这些处理，也逐渐受到关注。

研究背景与技术挑战
在细胞生物学研究中，成像技术一直是不可或缺的工具。传统的宽场荧光显微镜受到光学衍射极限的限制，无法满足研究者对细胞超微结构观察的需求。20世纪末至21世纪初，多种超分辨显微成像技术应运而生，其中结构光照明超分辨显微技术（SIM）因其较低的光漂白性和光毒性、较高的成像速度，成为主流的超分辨显微成像技术之一，尤其适合活细胞长时间成像。然而，固定和染色等处理过程不仅繁琐，还可能对样品的生物结构与活性造成干扰，并且存在光漂白和光毒性等问题。

而在无需荧光染料的情况下对样品进行观察的无标记显微成像技术，虽然其分辨率通常低于超分辨荧光显微技术，且无法实现特定结构的可视化，但无侵入性、简单便捷、能够进行长时间活体实验是其主要优势，因此一些无标记显微成像技术已经被广泛应用于临床诊断和分子医学等领域。随着生物医学领域的研究需求日益多样化，单一成像模式已难以满足科研人员的需求，成像模式的扩展变得尤为重要，因此结合多种成像模态的显微成像系统的研究意义重大。

技术创新与应用
SIM与ROCS的原理与结合
结构光照明超分辨显微技术（SIM）的原理是通过余弦形式的结构光照明将样品的高频信息编码至低频区域，采集原始图像后对高频分量进行分离和拼接，通过拓展图像频谱实现超分辨成像。旋转相干散射显微成像技术（ROCS）则是通过使用相位型空间光调制器（SLM）产生多个方向的斜照明光束照射样品，以照明光束完成360°的扫描为一个照明周期，在一个照明周期内相机保持持续曝光收集样品散射光，从而实现高分辨和高对比度的相干光无标记成像。结合SIM和ROCS这两种不同类型的成像方法，搭建了SIM-ROCS双模态显微成像系统，该系统可以在两种模式之间进行任意切换，既具备超分辨荧光显微成像功能，又具备高分辨率无标记成像功能，为细胞生物学的研究提供了新的工具。

系统搭建与硬件设计
所搭建的SIM-ROCS双模态显微成像系统主要由照明光路、荧光探测路和散射探测路三部分组成。照明光路中，激光器发出的线偏光经过一系列光学元件的处理后，通过空间滤波器（mask）进行空间滤波，根据成像模式的不同需求设计不同的mask，实现不同的空间滤波功能。在荧光探测路中，经物镜聚焦的结构光照射在样品上，激发荧光信号，依次通过物镜、二向色镜、发射滤光片等元件后在相机的靶面成像。而散射探测路则用于无标记ROCS成像，经物镜聚焦的激光照射在样品上激发散射光，依次通过物镜、二向色镜、光阑等元件后在相机的靶面成像。此外，系统中各模式涉及的不同器件之间的时序同步和触发设计也是关键，通过现场可编程门阵列（FPGA）进行整体触发控制，使系统达到微秒级精度的时序同步与控制，确保整个系统高效、正确地采集所需的图像。

成像实验与结果分析
荧光微球标准样品成像分析
通过使用100nm的荧光微球标准样品对SIM-ROCS双模态显微成像系统进行测试，在SIM和ROCS通道分别得到了111nm和145nm的空间分辨率。通过对单个微球图像沿中心的强度展开进行高斯拟合求取其半峰全宽（FWHM），得到SIM通道的空间分辨率为111.4nm，宽场荧光通道的分辨率为254.6nm，ROCS通道的高斯拟合后的FWHM为290.9nm。同时，通过瑞利判据和图像频谱宽度的倒数测量，ROCS系统的分辨率为145nm。

在同一视野下对200nm的荧光微球样品分别进行普通宽场荧光成像、SIM超分辨成像和ROCS散射成像，并对感兴趣的区域放大，结果显示在普通宽场图像中无法分辨的两个荧光微球，在ROCS图像中得以区分，说明ROCS成像模式有效提高了图像的分辨率。此外，对于可分辨的微球，ROCS模式下的强度分布有两个非常明确的峰值，可以对两个微球进行分辨，且ROCS图像中两点之间的距离比实际距离略宽，与理论相符。同时，ROCS模式在提高邻近物体之间的对比度方面也表现出色，峰值与谷值之间相差更大，有利于对图像进行分析和处理。

PANC-1胰腺癌细胞样品成像分析
对PANC-1胰腺癌细胞样品，使用荧光探针对其进行染色，并在ROCS和宽场荧光模式下对该样品进行成像。结果显示，宽场荧光和ROCS图像视野内的PANC-1细胞尖端有着较为清晰的伪足结构，并且对于细胞边界和伪足，ROCS图像的对比度高于宽场荧光图像。沿伪足部分做强度分布的展开，ROCS图像对于伪足这一结构的分辨率、对比度和信噪比均优于宽场荧光图像，边界清晰明显，更有利于对样品进行观察和分析。

此外，作为相干光无标记成像方法，ROCS在获得较高信噪比时所需的光剂量与荧光通道相比非常微小，光毒性更低。对PANC-1胰腺癌细胞的成像结果体现了ROCS对于伪足结构的成像优势，以及它在成像过程中所需光功率极小、光毒性远低于荧光成像的特点。

总结与展望
根据SIM和ROCS两种成像方法在原理和系统上的异同点设计并搭建了SIM-ROCS双模态成像系统，实现了超分辨荧光和无标记成像功能的集合。通过对荧光微球标准样品和PANC-1胰腺癌细胞样品在不同通道下的成像结果进行分析，验证了该系统的可行性和有效性。该系统在对标准样品成像的实验中性能表现良好，但在对生物样品的成像实验中由于样品和器件的限制，在荧光通道出现了信噪比偏低的现象，没有取得理想的成像结果。在将来的工作中，可以通过对样品和荧光染料的对比选择以及对分光器件和探测方案的优化，在保证ROCS通道成像质量的前提下进一步提高荧光通道的性能。此外，还可以开展由ROCS到SIM跨模态图像翻译的相关工作，探索更多成像技术的融合与创新，为细胞生物学的研究提供更加强大的成像工具，助力生物医学领域的研究取得更多的突破和进展。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：孙玮, 刘更亮, 文刚, 陈晓虎, 梁永, 李辉. 结构光照明超分辨荧光与旋转相干散射双模态成像[J]. 激光与光电子学进展, 2024, 61(20): 2011022. 

doi:10.3788/LOP241204.