光片荧光显微术（LSFM）凭借高速三维成像和低光损伤特性，成为多细胞系统四维生物学成像的重要工具，但其光片厚度通常大于1微米，难以解析活细胞内亚微米级精细结构。本文聚焦瑞典皇家理工学院研究团队开发的多片层可逆饱和光学荧光跃迁显微术（Multi-sheet RESOLFT），该技术通过可逆光开关荧光蛋白（RSFPs）与周期性光开关图案的结合，首次实现了亚100纳米级光片厚度的超分辨断层成像，并以1–2Hz的高速完成三维体积采集，为动态追踪细胞分裂、肌动蛋白运动及病毒样颗粒行为提供了全新视角。

重要发现者为Andreas Bodén、Ilaria Testa等，研究成果以《Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy》为题，发表在《Nature Methods》杂志。

重要发现
01传统光片成像的瓶颈与突破思路
传统光片显微术（如斜平面显微镜OPM）受光的衍射特性限制，即使采用高数值孔径物镜（NA~1.3），光片厚度也难以突破1–2微米，导致相邻亚细胞结构（如间隔<1微米的细胞膜）在成像中严重模糊。为解决这一问题，研究团队引入可逆饱和光学荧光跃迁（RESOLFT）原理，利用RSFPs的“开-关”双稳态特性——通过405nm宽场光将所有荧光蛋白激活为“开”状态，再以488nm正弦干涉图案光（周期1.2微米，倾斜35°）精准关闭大部分区域的荧光，仅保留纳米级厚度的发光片层。

02多片层并行化成像的核心机制
多片层RESOLFT的关键在于“光片印记-快速读取”的创新流程：
光片印记：通过调节“关闭光”的功率和持续时间，可将发光片层厚度压缩至100–200纳米，较传统OPM光片薄10倍以上（图1b）。
快速读取：使用488nm光片逐片激发印记的发光层，通过匹配光片间距与读取光的艾里斑零强度点，避免相邻层串扰。单次体积成像仅需10–20次荧光开关循环，显著降低光漂白风险。

此外，该技术成功记录了HeLa细胞4小时内的分裂全过程（图5），以及病毒样颗粒在细胞膜表面的动态聚集（图6），展现了其在动态生物学研究中的强大潜力。

创新与亮点
01突破衍射极限的“纳米级光片”
传统光片成像的分辨率由光片厚度和检测系统共同决定，而多片层RESOLFT通过光学调控荧光蛋白开关状态，绕过了光的物理衍射限制。实验显示，其有效光片厚度可稳定控制在100–200纳米，使三维体积分辨率达到250纳米以下（x/y/z轴），首次在光片技术中实现了“超分辨断层”能力。

03兼容性与多功能拓展
该技术对RSFPs的开关循环次数要求极低，可兼容rsEGFP2、rsEGFP(N205S)等多种荧光蛋白，并支持多色成像拓展。此外，其光学系统基于商用组件构建（仅衍射光栅需定制），兼容标准盖玻片，为高通量活细胞成像奠定了基础。

总结与展望
多片层RESOLFT显微术通过光片技术与超分辨原理的跨维度融合，突破了传统光学成像在分辨率、速度与光损伤之间的固有矛盾，为解析亚细胞结构的时空动态提供了革命性工具。当前技术已实现140×84×15微米³体积的高速成像，未来通过升级激光器功率和相机灵敏度，有望将采集速度提升至0.5秒/体积以下，并进一步拓展至更大样本（如类器官）和更深组织（需结合像差校正技术）。

在应用层面，该技术可广泛用于肿瘤细胞迁移机制、病毒组装路径、细胞器互作网络等前沿领域，甚至为实时监测药物对亚细胞结构的动态影响提供可能。随着RSFPs光谱多样性的提升和自动化算法的优化，多片层RESOLFT或将推动光片成像从“宏观观察”迈向“纳米级动态解析”，成为连接分子生物学与细胞生物学的关键桥梁。

正如研究团队在讨论中指出，这项技术不仅是光学成像的一次技术突破，更预示着“智能光片”时代的到来——通过动态调控光开关图案与荧光蛋白行为，未来的光片显微镜或将实现分辨率、速度与成像深度的按需切换，为生命科学研究带来无限想象空间。

DOI:10.1038/s41592-024-02196-8.