引言

虾青素被称为“抗氧化之王”，其抗氧化能力是维生素的550倍，兼具抗癌、增强免疫力、保护心血管等多重功效。

天然提取虾青素需消耗大量水资源和土地且产量有限，而生物合成面临规模化生产的问题。预计全球虾青素市场到2030年供需缺口将达1-1.5万吨，中国缺口约3,000-5,000吨。如何提升生物合成虾青素效率成为填补缺口的关键。

图1.红发夫酵母结晶紫染色后的光镜图

本实验采用野生型的红法夫酵母，相较于基因编辑菌，野生菌在天然构型安全性、市场合规性上更具竞争力，但通常野生型菌株的产量较低。

发酵设备使用高通量平行生物反应器+一次性罐体的工艺系统组合，进行工艺参数的快速优化，最终在培养温度20℃，pH 4.5，发酵119h后虾青素含量达到了327.73mg/L，虾青素的含量提高了7.6 倍，培养周期缩短了70h（预实验中培养基优化筛选中发酵189h,虾青素含量42.91mg/L）。验证了这套系统能够用于野生红法夫酵母菌株高产虾青素的快速优化培养。

材料与方法

菌株：
红法夫酵母：菌株编号GDMCC 2.218；
来源：广东省微生物菌种保藏中心。

实验设备：
CloudReady^® + Endura SUB^® 0.5L 一次性罐体×8-（迪必尔生物）；Arc HPLC（Waters）

图2.CloudReady^®云平台生物反应器8联（一次性罐体）

软件系统：
D2MS(设备和数据管理系统, Device & Data management system）Pro

实验场所：
迪必尔生物 应用技术与工程研究中心（CARE）

实验过程

培养基：
初始培养基和补料培养基，由预实验（培养189h，虾青素产量为42.91mg/L）结果优化获得。如表1所示。

表1 实验培养基

工艺条件设置：
（1）温度梯度的优化实验
首先选用4台CloudReady^® 预先进行温度梯度的优化实验，4个反应器分别标记为R1a，R2a，R3a，R4a。具体各罐台参数条件设置如下表所示。

表2 温度梯度优化实验工艺参数设置

（2）pH梯度的优化实验
选用另4台CloudReady^®进行pH梯度的优化，四个罐台分别标记为R1，R2，R3，R4。

为了缩短优化周期，在初次预设值的实验进行到了第3d的时候，继续本次实验测试，为节约准备时间罐体采用一次性罐体（如图3所示）。具体各罐台参数条件设置如表3所示。

图3.Endura SUB^® 一次性罐体

表3 pH梯度优化实验工艺参数设置

虾青素测定方法：
（1）红法夫酵母虾青素的处理，选用酸热法^[2]。
（2）红法夫酵母虾青素的分析：采用HPLC法进行分析测试^[3]。

液相设备：色谱条件为Waters XBridge^® C18柱 (4.6×50mm)；流动相为甲醇-水(95:5)；流速为1mL/min；检测波长为475nm。

实验结果与分析
（1）温度梯度的优化实验
按照表1的工艺条件设计， 如图4所示，R1a和R2a罐台菌体生长缓慢，在培养到46.4h的时候下罐放弃培养。R3a和R4a罐台继续培养到168h后放罐。如图5所示，其中R3a罐台在培养到118h有最优的实验结果，OD₆₀₀ 24.84，其中虾青素的含量为88.76mg/L,比预实验的虾青素的含量提高了，培养周期缩短了71h（预实验中培养基优化筛选中, 发酵189h,虾青素含量42.91mg/L）。

图4.R1a-R4a罐台批次生长曲线

图5.R1a-R4a虾青素的生长曲线

（2）pH梯度的优化实验
按照表2的工艺条件设计，如图6所示，其中R1罐台在pH3.5的条件下菌体生长缓慢，培养到46h后做放罐处理。其它罐台生长正常，继续培养到144h，如图7所示，其中R3罐台在培养到119h有最优的实验结果，OD₆₀₀ 35.8，湿重84.1g/L，其中虾青素的含量为327.73mg/L，在短时间优化后快速的将虾青素的含量提高了7.6倍，培养周期缩短了70h（预实验中培养基优化筛选中, 发酵189h,虾青素含量42.91mg/L）。

图6.R1-R4批次生长曲线
图7.R1-R4罐台虾青素生产曲线

（3）如图8所示，随着培养过程的进行，虾青素的含量也在快速的生产，发酵菌液的颜色也由浅黄色慢慢的变成深红色。

图8.虾青素生产的罐体局部放大图

总结
本次研究利用了CloudReady^®云平台生物反应器高通量平行、智能化、可拓展的优势，以及Endura SUB^®一次性罐体与玻璃罐高度一致性、显著提升工艺开发和优化效率的特点，在21天的时间里实现了虾青素产量7.6倍的提升。

未来，随着菌株改造、智能算法优化（AI动态调控）的深化，虾青素生产成本有望进一步降低，推动其在食品、医药、护肤等领域的规模化应用。

参考文献
[1] 姜文涛,韩丽影,等. 产虾青素红法夫酵母的发酵工艺优化[J]. 饲料博览,2021, 12: 13-18.
[2] 李贤宇,肖冬光. 红法夫酵母细胞内虾青素的提取方法研究[C].2005年工业微生物研讨会，2005:501-506.
[3] 饶毅,曾恋情,等.高效液相法测定虾青素的含量[J].江西中医药大学学报,2014,26(5):86-88.

注：本文实验数据及图片版权归迪必尔生物工程（上海）有限公司所有，未经授权禁止转载。
原文作者：应用技术与工程研究中心（CARE）石兴利。