文献信息
北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所，核医学科，国家药监局放射性药物研究与评价重点实验室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室的研究成果Novel Peptide-Based ⁶⁸Ga-Labeled Radiotracer for Preclinical Studies of TIM3 Expression（新型肽基⁶⁸Ga标记放射性示踪剂用于TIM3表达的临床前研究）在学术期刊《MOLECULAR PHARMACEUTICS》发表。平生公司的小动物PET/CT（型号：Super Nova）产品在论文中提供了重要的肿瘤小鼠PET/CT图像和定量分析。

该研究的通讯作者为北肿朱华研究员、赵传科副研究员。第一作者为陶金萍同学，王菲大夫。

陶金萍，王菲，曾子晴，周文媛，王紫蕾，何成雪，朱锦玉，赵传科，朱华

文献背景
T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3（TIM3）是一种免疫检查点，在免疫反应中起负调控作用。TIM3靶向药物抑制这种负调控，从而调节免疫反应激活的水平。在之前的研究中，通过噬菌体肽库筛选鉴定出了几种靶向TIM3的肽。本研究根据靶向TIM3药物会导致干扰素-γ（IFN-γ）分泌增加的特点，选择了三种肽构建放射性分子探针。进行分子对接以评估所选肽与TIM3蛋白的结合特性。为了进一步增强靶向特性，对其中一种具有较高亲和力的肽进行了结构修饰。然后，通过用⁶⁸Ga核糖探针标记六种肽，使用⁶⁸Ga构建肽探针⁶⁸Ga-DOTA肽，并使用TIM3过表达细胞系A549^TIM3和亲本A549细胞评估结合亲和力和特异性。此外，在Micro-PET/CT成像中，通过尾静脉注射3.7-7.4MBq ⁶⁸Ga-DOTA肽后，对转染模型小鼠进行动态成像30分钟。同时，在MC38模型（小鼠中的癌症）和CCRCC（透明细胞肾细胞癌）异种移植模型中注射相同剂量的分子探针，然后在注射后15、30和60分钟进行静态扫描。最后，进行免疫组织化学（IHC）染色以评估TIM3在解剖的肿瘤组织中的表达。分子对接结果表明，P26与TIM3蛋白的结合能为-6.5 kcal/mol，低于P24与TIM3蛋白质的结合能-3.6 kcal/mol。对P26肽进行结构修饰后，获得P26NH₂、r-NH₂和P26X₂，并通过⁶⁸Ga标记将上述肽成功构建成6个靶向TIM3肽探针。细胞摄取实验表明，⁶⁸Ga-DOTA-P26、⁶⁸Ga-DODA-P26NH₂和⁶⁸Ga-DOTA-r-NH₂在A549^TIM3细胞中的摄取明显高于A549细胞，并且可以被未标记的肽阻断。Micro-PET成像实验表明，每种探针在A549^TIM3模型肿瘤组织中的摄取量明显高于A549模型肿瘤组织，对各组肿瘤与心脏摄取率的比较表明，⁶⁸Ga-DOTA-P26在A549^TIM3模型中的肿瘤与心脏的摄取率优于其他几种分子探针，在MC38模型中也得到了类似的结果，但不同的是，⁶⁸GaDOTA-P26NH₂在CCRCC模型中的瘤心摄取率最高。最后，IHC的验证表明，A549^TIM3、MC38和CCRCC肿瘤组织具有不同程度的TIM3表达。通过比较离体和体内研究，其中一种⁶⁸Ga-DOTA-P26探针对TIM3表现出显著的靶特异性。这些结果表明，研究靶向TIM3的肽探针将促进TIM3靶向药物研究的进程，并有望指导TIM3免疫检查点药物在免疫治疗中的应用。

实验方法
微PET成像研究
通过皮下注射3×10⁶ MC38细胞在C57BL/6J小鼠中建立MC38模型，通过皮下注射1×10⁶A549^TIM3和A549细胞建立BALB/c裸鼠模型，通过在NOD SCID小鼠中皮下接种CCRCC患者的肿瘤组织块构建CCRCC模型。当肿瘤体积达到100-300mm³时，使用小鼠进行成像。对于静态成像，MC38肿瘤模型和CCRCC肿瘤模型通过尾静脉注射7.4 MBq的⁶⁸Ga-DOTA-P26、⁶⁸Ga-DODA-P24、⁶⁸Ga-TOTA-P20、⁶⁸Ga-DOTA-P26NH₂、⁶⁸Ga-OTA-r-NH₂和⁶⁸Ga-DOTA-P26X₂，并在15、30和60分钟时使用微型PET扫描仪采集600秒的图像。重建图像，绘制感兴趣区域（ROI），并将定量数据表示为每克组织注射剂量的百分比（%ID/g）。

使用微型PET/CT进行动态成像研究

A549和A549^TIM3荷瘤小鼠经尾静脉注射约7.4 MBq ⁶⁸Ga-DOTA肽，然后立即进行动态Micro-PET/CT成像60分钟，然后进行高分辨率CT（计算机断层扫描）扫描以供解剖参考。PET数据被重建为10分钟、20分钟和30分钟。结果表示为每克组织注射剂量的百分比（%ID/g）。

实验结果
A549/A549^TIM3模型中⁶⁸Ga-DOTA肽的微PET/CT成像。使用六肽放射性探针在A549和A549^TIM3荷瘤小鼠中进行了微PET/CT成像。给药后用2%异氟烷进行麻醉，然后在微型PET/CT（Super Nova PET/CT，平生医疗科技有限公司）上完成30分钟的动态扫描，并获得微型PET/CT最大强度投影图像，如图4A所示。在A549^TIM3小鼠的成像中，在注射放射性肽探针后10分钟观察到清晰的成像结果，这些探针在30分钟内从体内迅速代谢。除了⁶⁸Ga-DOTA-P24探针在A549和A549^TIM3肿瘤小鼠中的摄取值没有显著差异（图4C）外，其他⁶⁸Ga-DOTA肽在A549^TIM3和A549肿瘤中的摄取量在10分钟时存在显著差异（⁶⁸Ga-DODA-P26:1.39±0.022%ID/g vs 1.01±0.012%ID/g；⁶⁸Ga-DOA-P20:1.74±0.017%ID/g vs 1.05±0.021%ID/g；⁶⁸Ga-DOTA-P26NH₂：1.93±0.024%ID/g vs 1.70±0.008%ID/g；⁶⁸Ga-DOTA-rNH₂:1.81±0.017%ID/g vs1.64±0.029%ID/g；⁶⁸Ga-DOT A-P26X₂:1.18±0.024%ID/g vs1.59±0.033%ID/g ；p>0.01）（图4B，D-G）；然而，A549肿瘤对⁶⁸Ga-DOTA-P26X₂的摄取高于A549^TIM3，这表明⁶⁸Ga-DOTA-P26X₂在体内对TIM3没有明显的靶向作用。注射后10分钟六肽放射性示踪剂的图像清楚地显示，很大一部分放射性示踪剂在肾脏中积聚，表明示踪剂在肾脏代谢，其余部分分布在心血池和肿瘤部位（图4A）。

图4 肿瘤模型中的微PET/CT成像。（A） 注射⁶⁸Ga-DOTA肽探针后10分钟、20分钟和30分钟，用Micro-PET/CT对A549/A549^TIM3异种移植物模型进行成像，白色箭头表示肿瘤已定位。（B） 注射⁶⁸Ga-DOTA-P26后不同时间点A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；（C） 注射⁶⁸Ga-DOTA-P24后不同时间点A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；（D） 注射⁶⁸GaDOTA-P20后不同时间点A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；E： 注射⁶⁸Ga-DOTA-P26NH₂后不同时间点A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；（F） 注射⁶⁸Ga-DOTA-r-NH2后不同时间点A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；以及（G）注射⁶⁸Ga-DOTA-P26X₂后不同时间点A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g。

使用设备

                                                 Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外观图）