来源：药研课堂

01

细胞系

了解细胞系的来源、名称、形态特征、培养基以及特征特性是学习细胞实验的基础。简单划分为以下几种：

干细胞系：

正常细胞系：

肿瘤细胞系：

其他细胞系：

具体细胞系种类及内容置于文章底部。

02

细胞分选

细胞可通过多种方法分选出来。

流式细胞仪

实验原理：当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

实验目的：将特定的细胞从细胞群体中分选出来。

实验步骤：

1. 样本制备：

(1) 获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度(参考 Table 1)→避光置冰上运至

分选室→移入带过滤头的流式管→等待分选。

(2) 常用人外周血单个核细胞进行细胞分选，其步骤为：

1) 收集一管 EDTA 抗凝外周血，置于 15 mL 离心管中，并加入等量 PBS 溶液稀释，用

吸管充分吹打混匀;

2) 于另一个 15 mL 离心管中加入等体积 PBMC 分离液

3) 将 7 mL 稀释后的全血样品缓慢加入 PBMC 分离液上层，注意:倾斜 45 度缓慢加入，不可用力过大，避免将全血样品混入 PBMC 分离液中;

4) 置入离心机中，配平，1800 rpm 离心 20 min;

5) 离心后，缓慢取出离心管，于超净台内用吸管吸去大部分上清液(即血浆)，再用 1mL 移液枪轻微吸出与白膜层靠近的少部分上清液;

6) 继续用 1 mL 移液枪将白膜层吸出，转移至另一新的 15 mL 离心管中，加入 10 mL PBS溶液稀释，用吸管充分吹打混匀(目的:尽可能稀释、去除可能混有的 PBMC 分离液和血浆);

7) 置入离心机中，1800 rpm 离心 10min;

8) 弃上清，再加入 10 mL PBS，吹打混匀，1800 rpm 离心 10min，留取细胞沉淀即PBMC；

9) PBMC用PBS溶液重悬后，可根据想要分选的细胞类型，选择特定的荧光抗体marker，进行染色，用于后续分析。

2. 细胞分选：

(1) 建立一个新的 Sort Layout。在已有的 Experiment 中，选中 Sort 菜单下的 New Sort Layout。

(2) 在 Sort Layout 窗口输入合适的选项。

• 从 Device 选项中选择合适的收集装置。

• 从 Precision 选项中选择 Purity。

• 在 Target Events（分选细胞数）下选择数目、输入数字或选continuous

• 选中分选方向（Left 或 Right），在相应的方向，添加要分选的细胞群（门）。

(3) 开始分选：

• 放入收集管。

• 上样。

• 设定合适的收集速率。速率低时分选效果比较好。一般< 8.0。

• 打开 Votage。

• 点击 Sort Layout 上的“Sort”。

• 此时出现一个对话框，提示是否打开 Waste Drawer。如果确定开始

分选，点击 “OK”。

• 如果 Target Events 选择了“Continuous”，仪器将持续分选，直至点击“Sort”或“Acquire”手动停止分选。从 Sort Layout 窗口可监测分选的进度，分选的细胞数显示在相应的区域。在相关的计数区显示分选速率。

(4) 分选完成

免疫磁珠

实验原理：用免疫磁珠做细胞分选是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法， MACS（magnetic-activated cell sorting）磁珠分选的原理：MACS 分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性，不在分选柱内停留，进而使细胞得以分离。分为有柱式分选和无柱式分选。

实验目的：将特定的细胞从细胞群体中分选出来。以下以从人外周血中阳性分选获得 T 细胞为例。

实验步骤：

1. 制备样本：通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs）。

2. 磁珠与样本进行孵育

注意：1）说明书上建议的体积用量适用的细胞数量≤107；若细胞数量＜107，请使用说明书中建议的数量；若细胞数量≥107，则加大试剂用量（例如：若细胞数量为 2x107，则试剂用量为说明书建议用量的两倍）。2 ） 为 保 证 最 佳 分 选 效 果 ， 防 止 堵 塞 分 选 柱 ， 在 磁 分 选 前 使 用 30 μ m 滤 器(Pre-SeparationFilters # 130-041-407)过滤，去除细胞团块。

（1）进行细胞计数；

（2）300×g 离心 10 分钟，用移液枪吸去上清；

（3）80 μL buffer 重悬细胞；

（4）加入 20μL CD3 MicroBeads ，混匀，在 4-8℃冰箱中孵育 15 min；

（5）用 1-2 mL buffer 洗涤细胞，300×g 离心 10 分钟，用移液枪吸去上清；

（6）用 500μL buffer 重悬细胞；

3. 上柱分选

注意：根据总细胞数量和 CD3+细胞数量，选择合适的分选柱和分选器

（1）将分选柱放在分选器合适位置上；

（2）润柱。MS 分选柱——使用 500µL buffer；LS 分选柱——使用 3mL Buffer。

（3）用移液枪将样本加在分选柱上；

（4）收集没有被磁珠标记的细胞，对于样本管/分选柱，用 500 µL Buffer 冲洗三次MS 分选柱；用 3 mL Buffer 冲洗三次 LS 分选柱。解螺旋 http://www.helixlife.cn/

4. 洗脱

（1）将分选柱移出磁场环境，放在新的 15mL 收集管上；

（2）在分选柱上加适量的 Buffer（MS 分选柱：1mL；LS 分选柱：5mL），用分选柱配备的活塞，快速的推下去，使得 Buffer 缓冲液能够将分选柱上被磁性标记的细胞洗脱下来，并收集在新的 15mL 收集管里，即为目的细胞（CD3+细胞）。