人卵泡抑素重组巴斯德毕赤酵母工程菌制备
2025-04-25 来源:威尼德生物科技 点击次数:204
摘要
研究旨在构建高效表达人卵泡抑素（hFS）的重组巴斯德毕赤酵母工程菌。通过基因合成、质粒构建及电穿孔转化技术，将hFS基因整合至酵母基因组中，筛选高拷贝转化子并优化表达条件。采用某试剂进行蛋白纯化及Western blot验证，最终获得可溶性hFS蛋白。实验表明，工程菌在甲醇诱导下可实现hFS高效表达，为后续规模化生产奠定基础。
引言
人卵泡抑素（hFS）是一种糖蛋白激素，在生殖调控、细胞分化及代谢疾病治疗中具有重要应用价值。传统哺乳动物细胞表达系统成本高且效率低，而巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）凭借其强启动子、高分泌效率及易于高密度发酵等优势，成为重组蛋白表达的理想宿主。目前，hFS在酵母系统中的表达仍面临基因整合效率低、翻译后修饰差异等问题。
研究通过优化基因合成与质粒设计，利用威尼德电穿孔仪提高转化效率，结合多拷贝筛选策略，构建高效表达hFS的工程菌株。同时系统优化诱导条件，提升目标蛋白产量与活性，为hFS的工业化生产提供技术支持。
实验部分
1. 材料与方法
1.1 菌株与质粒
宿主菌：巴斯德毕赤酵母GS115（His-表型）。
表达载体：pPIC9K，含AOX1强启动子及α-factor信号肽序列。
1.2 培养基与试剂
YPD培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。
BMGY/BMMY培养基：用于酵母预培养及甲醇诱导表达。
某试剂限制性内切酶、连接酶及DNA纯化试剂。
某试剂His标签纯化柱及Western blot检测试剂。
1.3 hFS基因合成与质粒构建
根据GenBank中hFS基因序列（登录号：NM_001465），优化密码子以适应酵母偏好性，化学合成全基因序列。
采用某试剂限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切pPIC9K载体，与hFS基因片段连接，构建重组质粒pPIC9K-hFS。
通过威尼德分子杂交仪验证质粒完整性，并测序确认。
1.4 电穿孔转化与多拷贝筛选
将线性化质粒pPIC9K-hFS（经Sal I酶切）通过威尼德电穿孔仪导入GS115感受态细胞，参数设置为：电压1500 V，脉冲时间5 ms。
转化液涂布MD平板（1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%葡萄糖），30℃培养3天。
高拷贝转化子筛选：依次使用含0.5、1.0、2.0 mg/mL某试剂G418的YPD平板梯度筛选，挑取抗性最强菌株。
1.5 表达条件优化
初筛菌株接种至BMGY培养基（30℃、250 rpm），OD600达6时转至BMMY培养基（含0.5%甲醇），每24 h补加甲醇至终浓度1%。
优化参数：诱导温度（20℃、25℃、30℃）、初始pH（5.0、6.0、7.0）、甲醇补加浓度（0.5%、1.0%、1.5%）。
离心收集上清，某试剂BCA法测定蛋白浓度。
1.6 蛋白纯化与鉴定
上清液经0.22 μm滤膜过滤后，加载至某试剂Ni-NTA亲和层析柱，洗脱液含250 mM咪唑。
SDS-PAGE及Western blot检测：使用某试剂抗hFS单克隆抗体（1:2000稀释），威尼德紫外交联仪进行膜转印。
结果与讨论
2.1 重组质粒构建与转化验证
酶切及测序结果表明，hFS基因正确插入pPIC9K载体。
威尼德原位杂交仪检测显示，高拷贝菌株基因组中整合3-5个hFS表达盒。
2.2 表达条件优化结果
最适诱导温度为25℃，初始pH 6.0，甲醇浓度1.0%。
在此条件下，hFS表达量达120 mg/L，较未优化组提高2.3倍。
2.3 蛋白纯化与活性分析
Ni-NTA纯化后获得单一目的条带（约35 kDa），纯度>90%。
Western blot显示特异性结合信号，证实为完整hFS蛋白。
讨论
研究通过优化基因整合策略与诱导条件，显著提升了hFS在毕赤酵母中的表达效率。威尼德电穿孔仪的高转化效率（>10^5 CFU/μg DNA）对多拷贝菌株筛选至关重要。此外，低温诱导（25℃）可能通过减缓蛋白折叠压力，提高可溶性表达比例。后续研究需进一步验证hFS的糖基化修饰及生物活性。
结论
成功构建高效表达人卵泡抑素的重组巴斯德毕赤酵母工程菌，优化后蛋白产量达120 mg/L，纯度符合应用要求。本实验为hFS的规模化生产及功能研究提供了可靠技术平台。
参考文献
1. 尤汉宁,李定国,黄新,等.人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆[J].上海第二医科大学学报.2004,(1).DOI:10.3969/j.issn.1674-8115.2004.01.006 .
2. 黄新,李定国,陆汉明,等.激活素和卵泡抑素mRNA在肝纤维化形成过程中的作用[J].中华肝脏病杂志.2002,(2).DOI:10.3760/j.issn:1007-3418.2002.02.001 .
3. 黄新,李定国,王志荣,等.肝纤维化形成过程中激活素A的表达变化[J].中华消化杂志.2001,(6).DOI:10.3760/j.issn:0254-1432.2001.06.007 .
4. Evans LW,Hughes RD.Activin A and follistatin in acute liver failure.[J].European journal of gastroenterology & hepatology.2003,15(2).
5. Wankell M,Goppelt A,Hans W,等.Impaired wound healing in transgenic mice overexpressing the activin antagonist follistatin in the epidermis.[J].The EMBO Journal.2001,20(19).
6. Ohga E.,Teramoto S.,Ouchi Y.,等.Activin receptors are expressed on human lung fibroblast and activin A facilitates fibroblast-mediated collagen gel contraction[J].中国科学C辑（英文版）.2000,66(17).
7. Kimitaka Kogure,You-Qing Zhang,Akito Maeshima,等.The role of activin and transforming growth factor-β in the regulation of organ mass in the rat liver[J].Hepatology.2000,31(4).916-921.
研究旨在构建高效表达人卵泡抑素（hFS）的重组巴斯德毕赤酵母工程菌。通过基因合成、质粒构建及电穿孔转化技术，将hFS基因整合至酵母基因组中，筛选高拷贝转化子并优化表达条件。采用某试剂进行蛋白纯化及Western blot验证，最终获得可溶性hFS蛋白。实验表明，工程菌在甲醇诱导下可实现hFS高效表达，为后续规模化生产奠定基础。
引言
人卵泡抑素（hFS）是一种糖蛋白激素，在生殖调控、细胞分化及代谢疾病治疗中具有重要应用价值。传统哺乳动物细胞表达系统成本高且效率低，而巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）凭借其强启动子、高分泌效率及易于高密度发酵等优势，成为重组蛋白表达的理想宿主。目前，hFS在酵母系统中的表达仍面临基因整合效率低、翻译后修饰差异等问题。
研究通过优化基因合成与质粒设计，利用威尼德电穿孔仪提高转化效率，结合多拷贝筛选策略，构建高效表达hFS的工程菌株。同时系统优化诱导条件，提升目标蛋白产量与活性，为hFS的工业化生产提供技术支持。
实验部分
1. 材料与方法
1.1 菌株与质粒
宿主菌：巴斯德毕赤酵母GS115（His-表型）。
表达载体：pPIC9K，含AOX1强启动子及α-factor信号肽序列。
1.2 培养基与试剂
YPD培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。
BMGY/BMMY培养基：用于酵母预培养及甲醇诱导表达。
某试剂限制性内切酶、连接酶及DNA纯化试剂。
某试剂His标签纯化柱及Western blot检测试剂。
1.3 hFS基因合成与质粒构建
根据GenBank中hFS基因序列（登录号：NM_001465），优化密码子以适应酵母偏好性，化学合成全基因序列。
采用某试剂限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切pPIC9K载体，与hFS基因片段连接，构建重组质粒pPIC9K-hFS。
通过威尼德分子杂交仪验证质粒完整性，并测序确认。
1.4 电穿孔转化与多拷贝筛选
将线性化质粒pPIC9K-hFS（经Sal I酶切）通过威尼德电穿孔仪导入GS115感受态细胞，参数设置为：电压1500 V，脉冲时间5 ms。
转化液涂布MD平板（1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%葡萄糖），30℃培养3天。
高拷贝转化子筛选：依次使用含0.5、1.0、2.0 mg/mL某试剂G418的YPD平板梯度筛选，挑取抗性最强菌株。
1.5 表达条件优化
初筛菌株接种至BMGY培养基（30℃、250 rpm），OD600达6时转至BMMY培养基（含0.5%甲醇），每24 h补加甲醇至终浓度1%。
优化参数：诱导温度（20℃、25℃、30℃）、初始pH（5.0、6.0、7.0）、甲醇补加浓度（0.5%、1.0%、1.5%）。
离心收集上清，某试剂BCA法测定蛋白浓度。
1.6 蛋白纯化与鉴定
上清液经0.22 μm滤膜过滤后，加载至某试剂Ni-NTA亲和层析柱，洗脱液含250 mM咪唑。
SDS-PAGE及Western blot检测：使用某试剂抗hFS单克隆抗体（1:2000稀释），威尼德紫外交联仪进行膜转印。
结果与讨论
2.1 重组质粒构建与转化验证
酶切及测序结果表明，hFS基因正确插入pPIC9K载体。
威尼德原位杂交仪检测显示，高拷贝菌株基因组中整合3-5个hFS表达盒。
2.2 表达条件优化结果
最适诱导温度为25℃，初始pH 6.0，甲醇浓度1.0%。
在此条件下，hFS表达量达120 mg/L，较未优化组提高2.3倍。
2.3 蛋白纯化与活性分析
Ni-NTA纯化后获得单一目的条带（约35 kDa），纯度>90%。
Western blot显示特异性结合信号，证实为完整hFS蛋白。
讨论
研究通过优化基因整合策略与诱导条件，显著提升了hFS在毕赤酵母中的表达效率。威尼德电穿孔仪的高转化效率（>10^5 CFU/μg DNA）对多拷贝菌株筛选至关重要。此外，低温诱导（25℃）可能通过减缓蛋白折叠压力，提高可溶性表达比例。后续研究需进一步验证hFS的糖基化修饰及生物活性。
结论
成功构建高效表达人卵泡抑素的重组巴斯德毕赤酵母工程菌，优化后蛋白产量达120 mg/L，纯度符合应用要求。本实验为hFS的规模化生产及功能研究提供了可靠技术平台。
参考文献
1. 尤汉宁,李定国,黄新,等.人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆[J].上海第二医科大学学报.2004,(1).DOI:10.3969/j.issn.1674-8115.2004.01.006 .
2. 黄新,李定国,陆汉明,等.激活素和卵泡抑素mRNA在肝纤维化形成过程中的作用[J].中华肝脏病杂志.2002,(2).DOI:10.3760/j.issn:1007-3418.2002.02.001 .
3. 黄新,李定国,王志荣,等.肝纤维化形成过程中激活素A的表达变化[J].中华消化杂志.2001,(6).DOI:10.3760/j.issn:0254-1432.2001.06.007 .
4. Evans LW,Hughes RD.Activin A and follistatin in acute liver failure.[J].European journal of gastroenterology & hepatology.2003,15(2).
5. Wankell M,Goppelt A,Hans W,等.Impaired wound healing in transgenic mice overexpressing the activin antagonist follistatin in the epidermis.[J].The EMBO Journal.2001,20(19).
6. Ohga E.,Teramoto S.,Ouchi Y.,等.Activin receptors are expressed on human lung fibroblast and activin A facilitates fibroblast-mediated collagen gel contraction[J].中国科学C辑（英文版）.2000,66(17).
7. Kimitaka Kogure,You-Qing Zhang,Akito Maeshima,等.The role of activin and transforming growth factor-β in the regulation of organ mass in the rat liver[J].Hepatology.2000,31(4).916-921.
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