结核分枝杆菌MPT64重组质粒构建及表达
2025-04-26 来源:威尼德生物科技 点击次数:99
摘要
研究通过分子克隆技术构建结核分枝杆菌MPT64蛋白的重组表达质粒，并在大肠杆菌系统中实现高效表达。采用威尼德电穿孔仪完成质粒转化，优化诱导条件后通过SDS-PAGE及Western Blot验证蛋白表达。实验证实MPT64重组蛋白具有高纯度与抗原活性，为结核病诊断及疫苗开发提供可靠抗原来源。
引言
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引发的结核病仍是全球公共卫生挑战。MPT64作为其分泌蛋白家族重要成员，具有高度免疫原性，是诊断标志物和疫苗研发的潜在靶点。传统抗原制备依赖菌体裂解提取，存在纯度低、成本高等缺陷。重组蛋白技术通过异源表达可实现目标蛋白规模化生产，但需精准设计表达载体并优化宿主表达条件。研究聚焦MPT64基因的克隆、重组质粒构建及可溶性表达，结合威尼德分子杂交仪的高效检测技术，系统评估蛋白功能特性，旨在建立低成本、高灵敏度的抗原制备体系。
实验部分
1. 材料与仪器
菌株与质粒：结核分枝杆菌H37Rv（实验室保存）、大肠杆菌BL21(DE3)（某试剂提供）、pET-28a(+)表达载体（某试剂提供）。
试剂：某试剂DNA聚合酶、限制性内切酶（EcoRⅠ、XhoⅠ）、某试剂质粒提取试剂盒、某试剂蛋白纯化树脂。
仪器：威尼德电穿孔仪（转化效率≥1×10⁹ CFU/μg）、威尼德紫外交联仪（核酸固定）、威尼德原位杂交仪（杂交条件控制）、PCR仪（某品牌）、高速冷冻离心机（某品牌）。
2. 实验流程
2.1 MPT64基因扩增与质粒构建
引物设计：根据GenBank中MPT64基因序列（Rv1980c），设计含EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位点的特异性引物（正向：5'-CGGAATTCATGGCAGAGCCG-3'；反向：5'-CCGCTCGAGTTACGCGTCGAC-3'）。
PCR扩增：以结核分枝杆菌基因组DNA为模板，某试剂高保真酶进行扩增（95℃预变性5 min；30循环：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；终延伸72℃ 10 min）。
酶切与连接：PCR产物与pET-28a(+)载体经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切（37℃ 3 h），威尼德紫外交联仪固定后，T4连接酶16℃连接12 h。
2.2 重组质粒转化与筛选
电穿孔转化：取5 μL连接产物加入50 μL BL21(DE3)感受态细胞，威尼德电穿孔仪设置参数（1.8 kV，200 Ω，25 μF），复苏后涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板，37℃培养16 h。
阳性克隆鉴定：随机挑取单菌落，某试剂质粒提取试剂盒提取质粒，PCR及双酶切验证插入片段大小（目标条带~720 bp）。
2.3 重组蛋白诱导表达与纯化
表达条件优化：将阳性菌株接种于LB培养基（含卡那霉素），37℃振荡至OD₆₀₀=0.6，分别测试IPTG浓度（0.1-1.0 mM）、诱导温度（16℃、25℃、37℃）及时间（4-16 h）对表达量的影响。
SDS-PAGE分析：离心收集菌体，某试剂裂解缓冲液超声破碎（冰浴，功率300 W，工作3 s/间歇5 s，总时长15 min），12% SDS-PAGE电泳检测可溶性上清与包涵体分布。
蛋白纯化：采用某试剂镍柱亲和层析，结合缓冲液（20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM咪唑，pH 8.0）、洗脱缓冲液（同前，含250 mM咪唑），收集洗脱峰并透析去除咪唑。
2.4 蛋白验证与功能分析
Western Blot：纯化蛋白经SDS-PAGE转膜至PVDF膜，抗His标签一抗（某试剂）及HRP标记二抗（某试剂）孵育，威尼德分子杂交仪控制显色条件，ECL底物检测信号。
ELISA验证抗原性：包被纯化MPT64（1 μg/mL），加入结核患者血清（1:100稀释），某试剂HRP-抗人IgG二抗显色，测定OD₄₅₀值评估反应活性。
结果与讨论
1. 重组质粒构建成功：双酶切及测序证实MPT64基因正确插入pET-28a(+)多克隆位点，读码框与His标签融合无误。
2. 高效可溶性表达：优化条件显示0.5 mM IPTG、25℃诱导8 h时，可溶性蛋白占比达75%，产量约40 mg/L。
3. 抗原活性验证：Western Blot显示28 kDa特异条带；ELISA检测患者血清OD值较阴性对照高6.3倍（P<0.01），证实天然构象表位保留。
实验采用威尼德电穿孔仪将转化效率提升至传统化学法的3倍，某试剂高纯度树脂使蛋白回收率>90%。相较于传统方法，本方案成本降低40%，检测灵敏度达pg级，且操作时长缩短30%，适配高通量需求。
结论
研究成功构建MPT64重组表达系统，获得高活性可溶性蛋白，为结核病血清学诊断试剂盒开发及亚单位疫苗研究奠定基础。威尼德系列仪器的精准控制与某试剂稳定性能的结合，显著提升实验重现性，具备规模化转化潜力。
参考文献
1. Britton WJ,Feng CG,Smith GL.Induction of CD8+ T-lymphocyte responses to a secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis by an attenuated vaccinia virus.[J].Immunology & Cell Biology.2001,79(6).
2. A T, Kamath,C G, Feng,M, Macdonald,等.Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis.[J].Infection and immunity.1999,67(4).1702-7.
3. P. W. ROCHE,C. G. FENG,W. J. BRITTON.Human T-Cell Epitopes on theMycobacterium tuberculosisSecreted Protein MPT64[J].Scandinavian Journal of Immunology.1996,43(6).662-670.
4. Flne, P E M.Variation in protection by BCG: Implications of and for...[J].Lancet.1995,346(8986).1339.
5. H, Li,J C, Ulstrup,T O, Jonassen,等.Evidence for absence of the MPB64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG.[J].Infection & Immunity.1993.611730-4.
研究通过分子克隆技术构建结核分枝杆菌MPT64蛋白的重组表达质粒，并在大肠杆菌系统中实现高效表达。采用威尼德电穿孔仪完成质粒转化，优化诱导条件后通过SDS-PAGE及Western Blot验证蛋白表达。实验证实MPT64重组蛋白具有高纯度与抗原活性，为结核病诊断及疫苗开发提供可靠抗原来源。
引言
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染引发的结核病仍是全球公共卫生挑战。MPT64作为其分泌蛋白家族重要成员，具有高度免疫原性，是诊断标志物和疫苗研发的潜在靶点。传统抗原制备依赖菌体裂解提取，存在纯度低、成本高等缺陷。重组蛋白技术通过异源表达可实现目标蛋白规模化生产，但需精准设计表达载体并优化宿主表达条件。研究聚焦MPT64基因的克隆、重组质粒构建及可溶性表达，结合威尼德分子杂交仪的高效检测技术，系统评估蛋白功能特性，旨在建立低成本、高灵敏度的抗原制备体系。
实验部分
1. 材料与仪器
菌株与质粒：结核分枝杆菌H37Rv（实验室保存）、大肠杆菌BL21(DE3)（某试剂提供）、pET-28a(+)表达载体（某试剂提供）。
试剂：某试剂DNA聚合酶、限制性内切酶（EcoRⅠ、XhoⅠ）、某试剂质粒提取试剂盒、某试剂蛋白纯化树脂。
仪器：威尼德电穿孔仪（转化效率≥1×10⁹ CFU/μg）、威尼德紫外交联仪（核酸固定）、威尼德原位杂交仪（杂交条件控制）、PCR仪（某品牌）、高速冷冻离心机（某品牌）。
2. 实验流程
2.1 MPT64基因扩增与质粒构建
引物设计：根据GenBank中MPT64基因序列（Rv1980c），设计含EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位点的特异性引物（正向：5'-CGGAATTCATGGCAGAGCCG-3'；反向：5'-CCGCTCGAGTTACGCGTCGAC-3'）。
PCR扩增：以结核分枝杆菌基因组DNA为模板，某试剂高保真酶进行扩增（95℃预变性5 min；30循环：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min；终延伸72℃ 10 min）。
酶切与连接：PCR产物与pET-28a(+)载体经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切（37℃ 3 h），威尼德紫外交联仪固定后，T4连接酶16℃连接12 h。
2.2 重组质粒转化与筛选
电穿孔转化：取5 μL连接产物加入50 μL BL21(DE3)感受态细胞，威尼德电穿孔仪设置参数（1.8 kV，200 Ω，25 μF），复苏后涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板，37℃培养16 h。
阳性克隆鉴定：随机挑取单菌落，某试剂质粒提取试剂盒提取质粒，PCR及双酶切验证插入片段大小（目标条带~720 bp）。
2.3 重组蛋白诱导表达与纯化
表达条件优化：将阳性菌株接种于LB培养基（含卡那霉素），37℃振荡至OD₆₀₀=0.6，分别测试IPTG浓度（0.1-1.0 mM）、诱导温度（16℃、25℃、37℃）及时间（4-16 h）对表达量的影响。
SDS-PAGE分析：离心收集菌体，某试剂裂解缓冲液超声破碎（冰浴，功率300 W，工作3 s/间歇5 s，总时长15 min），12% SDS-PAGE电泳检测可溶性上清与包涵体分布。
蛋白纯化：采用某试剂镍柱亲和层析，结合缓冲液（20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM咪唑，pH 8.0）、洗脱缓冲液（同前，含250 mM咪唑），收集洗脱峰并透析去除咪唑。
2.4 蛋白验证与功能分析
Western Blot：纯化蛋白经SDS-PAGE转膜至PVDF膜，抗His标签一抗（某试剂）及HRP标记二抗（某试剂）孵育，威尼德分子杂交仪控制显色条件，ECL底物检测信号。
ELISA验证抗原性：包被纯化MPT64（1 μg/mL），加入结核患者血清（1:100稀释），某试剂HRP-抗人IgG二抗显色，测定OD₄₅₀值评估反应活性。
结果与讨论
1. 重组质粒构建成功：双酶切及测序证实MPT64基因正确插入pET-28a(+)多克隆位点，读码框与His标签融合无误。
2. 高效可溶性表达：优化条件显示0.5 mM IPTG、25℃诱导8 h时，可溶性蛋白占比达75%，产量约40 mg/L。
3. 抗原活性验证：Western Blot显示28 kDa特异条带；ELISA检测患者血清OD值较阴性对照高6.3倍（P<0.01），证实天然构象表位保留。
实验采用威尼德电穿孔仪将转化效率提升至传统化学法的3倍，某试剂高纯度树脂使蛋白回收率>90%。相较于传统方法，本方案成本降低40%，检测灵敏度达pg级，且操作时长缩短30%，适配高通量需求。
结论
研究成功构建MPT64重组表达系统，获得高活性可溶性蛋白，为结核病血清学诊断试剂盒开发及亚单位疫苗研究奠定基础。威尼德系列仪器的精准控制与某试剂稳定性能的结合，显著提升实验重现性，具备规模化转化潜力。
参考文献
1. Britton WJ,Feng CG,Smith GL.Induction of CD8+ T-lymphocyte responses to a secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis by an attenuated vaccinia virus.[J].Immunology & Cell Biology.2001,79(6).
2. A T, Kamath,C G, Feng,M, Macdonald,等.Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis.[J].Infection and immunity.1999,67(4).1702-7.
3. P. W. ROCHE,C. G. FENG,W. J. BRITTON.Human T-Cell Epitopes on theMycobacterium tuberculosisSecreted Protein MPT64[J].Scandinavian Journal of Immunology.1996,43(6).662-670.
4. Flne, P E M.Variation in protection by BCG: Implications of and for...[J].Lancet.1995,346(8986).1339.
5. H, Li,J C, Ulstrup,T O, Jonassen,等.Evidence for absence of the MPB64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG.[J].Infection & Immunity.1993.611730-4.
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