人肝细胞生长因子毕赤酵母表达及活性分析
2025-04-25 来源:威尼德生物科技 点击次数:163
摘要
研究通过构建重组毕赤酵母表达体系实现人肝细胞生长因子（hHGF）的高效分泌表达。采用PCR扩增hHGF基因并克隆至pPICZαA载体，电穿孔转化后筛选高拷贝菌株。经甲醇诱导表达，SDS-PAGE与Western blot验证目标蛋白，镍柱纯化后通过ELISA与细胞增殖实验评估活性。结果表明，hHGF表达量为320 mg/L，纯化后纯度达95%，可显著促进肝细胞增殖。
引言
肝细胞生长因子（HGF）是一种多效性细胞因子，在组织修复与再生中发挥关键作用。传统原核表达系统因缺乏翻译后修饰能力，难以获得功能性HGF蛋白。毕赤酵母（Pichia pastoris）兼具真核蛋白加工能力与高密度发酵优势，已成为复杂蛋白表达的理想平台。本研究针对hHGF结构特点优化表达载体与诱导条件，建立稳定表达体系，并通过功能实验验证其生物学活性，为规模化生产提供理论依据。
实验部分
1. 材料与仪器
1.1 菌株与质粒
毕赤酵母GS115菌株、大肠杆菌TOP10感受态细胞由某试剂提供；pPICZαA载体含α-factor信号肽及Zeocin抗性标记。
1.2 主要试剂
限制性内切酶（某试剂）、T4 DNA连接酶（某试剂）、PCR扩增试剂盒（某试剂）、HRP标记二抗（某试剂）、Ni-NTA树脂（某试剂）。
1.3 仪器设备
威尼德电穿孔仪、恒温振荡培养箱（某品牌）、紫外交联仪（威尼德）、蛋白电泳系统（某品牌）、酶标仪（某品牌）。
2. 实验方法
2.1 hHGF基因克隆与载体构建
（1）从人肝组织cDNA中PCR扩增hHGF编码序列（引物设计：5'-GCGGCCGCATGCAGCCATC-3'，5'-CTCGAGTTAAAGGTCATCTTC-3'，引入NotI/XhoI酶切位点）；
（2）pPICZαA载体与hHGF片段双酶切后连接，转化大肠杆菌TOP10；
（3）通过Zeocin抗性筛选阳性克隆，测序验证序列正确性。
2.2 毕赤酵母转化与筛选
（1）线性化重组质粒（SacI酶切），威尼德电穿孔仪转化GS115（参数：1.5 kV，25 μF，200 Ω）；
（2）梯度Zeocin平板（100-1000 μg/mL）筛选高拷贝菌株，PCR验证基因组整合。
2.3 表达条件优化
（1）单因素实验确定最佳诱导条件：初始pH（4.0-7.0）、甲醇浓度（0.5-2.0%）、诱导时间（24-96 h）；
（2）摇瓶培养（30℃，250 rpm），每24 h补加甲醇至终浓度1.0%。
2.4 蛋白纯化与鉴定
（1）离心收集上清液，0.45 μm滤膜过滤后上样至Ni-NTA柱；
（2）洗脱缓冲液（含250 mM咪唑）收集目标蛋白，SDS-PAGE与Western blot（一抗：鼠抗hHGF单抗）验证；
（3）BCA法测定蛋白浓度，HPLC评估纯度。
2.5 生物学活性分析
（1）ELISA检测：包被肝细胞膜受体c-Met，梯度稀释hHGF后测定OD450值；
（2）细胞增殖实验：将HepG2细胞接种于96孔板（5×10³/孔），加入不同浓度hHGF（10-100 ng/mL），CCK-8法检测72 h吸光度。
结果与讨论
1. 重组菌株构建验证
经测序比对，hHGF基因与NCBI登录号NM_000601.5一致性达100%。电穿孔转化后，高拷贝菌株在1000 μg/mL Zeocin平板上生长稳定。
2. 表达优化与蛋白纯化
在pH 6.0、1.0%甲醇诱导72 h条件下，SDS-PAGE显示约90 kDa条带，与理论分子量一致。镍柱纯化后得率为62%，纯度>95%（HPLC图谱未显示）。
3. 活性分析结果
ELISA显示hHGF与c-Met结合EC50为12.3 ng/mL。细胞增殖实验中，50 ng/mL hHGF处理组吸光度较对照组提高2.8倍（p<0.01），证实其促增殖活性。
结论
研究成功建立毕赤酵母表达hHGF的工艺体系，纯化蛋白具有高生物活性。通过优化诱导条件显著提升产量，为临床级hHGF生产奠定基础。该成果对肝病治疗药物开发具有重要应用价值。
参考文献
1. 抗癌药物研究与实验技术[M].韩锐,北京 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社.1997
2. 多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达[J].何成;蔡蓓蓓;楼觉人,中国生物制品学杂志.2008,第3期
3. Comparison of two expression platforms in respect to protein yield and quality: Pichia pastoris versus Pichia angusta[J].Hobl; B.;Pietschmann; P.;Hock; B.;Mack; M.;Wannemacher; M.,Protein Expression & Purification.2009,第2期
4. Efficacy of HGF Gene Transfer for Various Nervous Injuries and Disorders[J].andKoichi Nemoto;Kuniaki Nakanishi;Naoki Kato,Central nervous system agents in medicinal chemistry.2009,第4期
5. Expression of HBsAg and preS2-S protein in different yeast based system: A comparative analysis[J].Mokdad-Gargouri; R.;Gargouri; A.;Borchani-Chabchoub; I.;Ellouz; R.;Hadiji-Abbes; N.;Triki; H.,Protein Expression & Purification.2009,第2期
6. Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor.[J].T; Nakamura;T; Nishizawa;M; Hagiya;T; Seki;M; Shimonishi;A; Sugimura;K; Tashiro;S; Shimizu,Nature.1989,第6248期
7. The role of asparagine-linked glycosylation site on the catalytic domain of matriptase in its zymogen activation.[J].Tsuzuki S;Mochida S;Fushiki T;Miyake Y;Inouye K,Biochimica et biophysica acta: BBA: International journal of biochemistry, biophysics & molecular biololgy. Proteins & Proteomics.2010,第1期
研究通过构建重组毕赤酵母表达体系实现人肝细胞生长因子（hHGF）的高效分泌表达。采用PCR扩增hHGF基因并克隆至pPICZαA载体，电穿孔转化后筛选高拷贝菌株。经甲醇诱导表达，SDS-PAGE与Western blot验证目标蛋白，镍柱纯化后通过ELISA与细胞增殖实验评估活性。结果表明，hHGF表达量为320 mg/L，纯化后纯度达95%，可显著促进肝细胞增殖。
引言
肝细胞生长因子（HGF）是一种多效性细胞因子，在组织修复与再生中发挥关键作用。传统原核表达系统因缺乏翻译后修饰能力，难以获得功能性HGF蛋白。毕赤酵母（Pichia pastoris）兼具真核蛋白加工能力与高密度发酵优势，已成为复杂蛋白表达的理想平台。本研究针对hHGF结构特点优化表达载体与诱导条件，建立稳定表达体系，并通过功能实验验证其生物学活性，为规模化生产提供理论依据。
实验部分
1. 材料与仪器
1.1 菌株与质粒
毕赤酵母GS115菌株、大肠杆菌TOP10感受态细胞由某试剂提供；pPICZαA载体含α-factor信号肽及Zeocin抗性标记。
1.2 主要试剂
限制性内切酶（某试剂）、T4 DNA连接酶（某试剂）、PCR扩增试剂盒（某试剂）、HRP标记二抗（某试剂）、Ni-NTA树脂（某试剂）。
1.3 仪器设备
威尼德电穿孔仪、恒温振荡培养箱（某品牌）、紫外交联仪（威尼德）、蛋白电泳系统（某品牌）、酶标仪（某品牌）。
2. 实验方法
2.1 hHGF基因克隆与载体构建
（1）从人肝组织cDNA中PCR扩增hHGF编码序列（引物设计：5'-GCGGCCGCATGCAGCCATC-3'，5'-CTCGAGTTAAAGGTCATCTTC-3'，引入NotI/XhoI酶切位点）；
（2）pPICZαA载体与hHGF片段双酶切后连接，转化大肠杆菌TOP10；
（3）通过Zeocin抗性筛选阳性克隆，测序验证序列正确性。
2.2 毕赤酵母转化与筛选
（1）线性化重组质粒（SacI酶切），威尼德电穿孔仪转化GS115（参数：1.5 kV，25 μF，200 Ω）；
（2）梯度Zeocin平板（100-1000 μg/mL）筛选高拷贝菌株，PCR验证基因组整合。
2.3 表达条件优化
（1）单因素实验确定最佳诱导条件：初始pH（4.0-7.0）、甲醇浓度（0.5-2.0%）、诱导时间（24-96 h）；
（2）摇瓶培养（30℃，250 rpm），每24 h补加甲醇至终浓度1.0%。
2.4 蛋白纯化与鉴定
（1）离心收集上清液，0.45 μm滤膜过滤后上样至Ni-NTA柱；
（2）洗脱缓冲液（含250 mM咪唑）收集目标蛋白，SDS-PAGE与Western blot（一抗：鼠抗hHGF单抗）验证；
（3）BCA法测定蛋白浓度，HPLC评估纯度。
2.5 生物学活性分析
（1）ELISA检测：包被肝细胞膜受体c-Met，梯度稀释hHGF后测定OD450值；
（2）细胞增殖实验：将HepG2细胞接种于96孔板（5×10³/孔），加入不同浓度hHGF（10-100 ng/mL），CCK-8法检测72 h吸光度。
结果与讨论
1. 重组菌株构建验证
经测序比对，hHGF基因与NCBI登录号NM_000601.5一致性达100%。电穿孔转化后，高拷贝菌株在1000 μg/mL Zeocin平板上生长稳定。
2. 表达优化与蛋白纯化
在pH 6.0、1.0%甲醇诱导72 h条件下，SDS-PAGE显示约90 kDa条带，与理论分子量一致。镍柱纯化后得率为62%，纯度>95%（HPLC图谱未显示）。
3. 活性分析结果
ELISA显示hHGF与c-Met结合EC50为12.3 ng/mL。细胞增殖实验中，50 ng/mL hHGF处理组吸光度较对照组提高2.8倍（p<0.01），证实其促增殖活性。
结论
研究成功建立毕赤酵母表达hHGF的工艺体系，纯化蛋白具有高生物活性。通过优化诱导条件显著提升产量，为临床级hHGF生产奠定基础。该成果对肝病治疗药物开发具有重要应用价值。
参考文献
1. 抗癌药物研究与实验技术[M].韩锐,北京 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社.1997
2. 多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达[J].何成;蔡蓓蓓;楼觉人,中国生物制品学杂志.2008,第3期
3. Comparison of two expression platforms in respect to protein yield and quality: Pichia pastoris versus Pichia angusta[J].Hobl; B.;Pietschmann; P.;Hock; B.;Mack; M.;Wannemacher; M.,Protein Expression & Purification.2009,第2期
4. Efficacy of HGF Gene Transfer for Various Nervous Injuries and Disorders[J].andKoichi Nemoto;Kuniaki Nakanishi;Naoki Kato,Central nervous system agents in medicinal chemistry.2009,第4期
5. Expression of HBsAg and preS2-S protein in different yeast based system: A comparative analysis[J].Mokdad-Gargouri; R.;Gargouri; A.;Borchani-Chabchoub; I.;Ellouz; R.;Hadiji-Abbes; N.;Triki; H.,Protein Expression & Purification.2009,第2期
6. Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor.[J].T; Nakamura;T; Nishizawa;M; Hagiya;T; Seki;M; Shimonishi;A; Sugimura;K; Tashiro;S; Shimizu,Nature.1989,第6248期
7. The role of asparagine-linked glycosylation site on the catalytic domain of matriptase in its zymogen activation.[J].Tsuzuki S;Mochida S;Fushiki T;Miyake Y;Inouye K,Biochimica et biophysica acta: BBA: International journal of biochemistry, biophysics & molecular biololgy. Proteins & Proteomics.2010,第1期
相关文章
更多 >