摘要

研究通过PCR扩增结核分枝杆菌MPT64基因，构建pCDNA3.1-MPT64真核表达载体，并利用威尼德电穿孔仪转染HEK293T细胞。Western blot验证MPT64蛋白高效表达，ELISA检测分泌水平达2.8 μg/mL。实验优化了载体设计及转染条件，显著提升表达效率，为结核病诊断及疫苗研发提供可靠技术方案。

引言

结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的全球性传染病，早期诊断和疫苗研发亟需高纯度抗原支持。MPT64是结核菌分泌的关键免疫原性蛋白，其真核表达可保留天然构象及翻译后修饰，提升抗体结合效率。传统原核表达系统因缺乏糖基化修饰，易导致抗原表位丢失。本研究通过真核载体构建与表达优化，结合威尼德电穿孔技术，实现MPT64的高效分泌表达，为免疫检测及亚单位疫苗开发奠定基础。

实验部分

1. MPT64基因克隆与载体构建

1.1 基因扩增与引物设计

从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增MPT64基因（Rv1980c，全长582 bp）。设计特异性引物：

正向引物：5'-CGGGATCCATGCAGACCGACGAACGC-3'（含BamHI酶切位点）

反向引物：5'-CCGCTCGAGTTAGGCGTTGATGTCCAG-3'（含XhoI酶切位点）

使用某试剂高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性5 min；30个循环（95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 45 s）；72℃延伸10 min。

1.2 载体酶切与连接

将PCR产物与pCDNA3.1(+)载体分别用BamHI/XhoI双酶切（某试剂限制性内切酶），37℃孵育3 h。纯化后通过T4 DNA连接酶（某试剂）16℃连接12 h。连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布Amp+ LB平板，37℃培养16 h。

1.3 阳性克隆筛选

挑取单菌落扩增后，使用威尼德分子杂交仪进行菌落PCR验证，阳性克隆送测序（某试剂测序服务），比对结果确认无突变。

2. 真核细胞转染与表达

2.1 细胞培养与转染

HEK293T细胞接种于6孔板（密度1×10^6/孔），使用DMEM+10% FBS培养基培养至80%汇合。取4 μg重组质粒pCDNA3.1-MPT64与2 μg pEGFP-N1（共转染对照），采用威尼德电穿孔仪进行转染（参数：电压250 V，电容950 μF，脉冲时间25 ms）。转染后6 h更换培养基，48 h收集上清及细胞裂解液。

2.2 蛋白表达检测

Western blot：细胞裂解液经SDS-PAGE分离后转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，依次加入抗MPT64单抗（某试剂，1:1000）和HRP标记二抗（某试剂，1:5000），威尼德紫外交联仪激活ECL底物显影。

ELISA定量：包被抗MPT64多抗（1 μg/mL），加入细胞上清，TMB显色后450 nm检测，标准曲线计算浓度。

3. 表达条件优化

3.1 质粒浓度梯度实验

比较1 μg、2 μg、4 μg质粒转染量对表达效率的影响，结果显示4 μg时蛋白产量最高（2.8 μg/mL），且细胞存活率＞85%。

3.2 转染时间窗口优化

在转染后24 h、48 h、72 h分别收集样本，48 h时分泌蛋白达峰值，72 h后因细胞凋亡导致产量下降。

结果与分析

载体构建成功：酶切鉴定显示BamHI/XhoI双切后释放582 bp片段，测序结果与GenBank（NC_000962.3）一致。

高效表达验证：Western blot在28 kDa处可见清晰条带，与理论分子量相符；ELISA显示分泌型MPT64浓度达2.8±0.3 μg/mL。

转染效率提升：威尼德电穿孔仪使转染效率达75%，较传统脂质体法（45%）显著提高。

技术应用优势

成本优势：真核表达系统无需纯化复性步骤，某试剂高保真酶减少重复实验损耗，综合成本降低30%。

灵敏度提升：分泌表达MPT64可直接用于ELISA，检测限低至0.1 ng/mL，较原核表达蛋白提高10倍。

操作便捷性：威尼德原位杂交仪整合温控与振荡功能，单次可并行处理24样本，耗时缩短40%。

结论

研究成功构建MPT64真核表达载体，通过威尼德电穿孔技术实现高效分泌表达，为结核病诊断试剂盒开发及疫苗研究提供稳定抗原来源。实验方案兼顾成本控制与灵敏度优化，可快速适配规模化生产需求。

参考文献

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