Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells

Keywords: Autophagy; Glaucoma; Mechanical stress; PI3K; Primary cilia; Trabecular meshwork.

眼压升高（IOP）是青光眼的主要危险因素，其是由于房水（AH）通过小梁网（TM）/施莱姆管（SC）流出通道组织的引流障碍，导致眼压稳态中断。流出通道中的细胞持续受到机械力的影响，如拉伸应力和剪切应力，分别是由 IOP 和 AH 流量的每日波动引起。研究表明，TM 和 SC 细胞能够通过各种生理反应感知和响应这些机械应力，这被认为是维持 IOP 稳态所必需的内在适应机制。

自噬的激活是一种适应性反应，初级纤毛（PC）是拉伸和剪切应力诱导的 TM 和 SC 细胞中自噬的关键机械传感器。初级纤毛作为细胞的信号枢纽，参与多种细胞内信号转导通路。研究发现，PC 依赖性拉伸诱导的自噬是由人 TM（HTM）细胞中 AKT 和 SMAD2/3 信号之间的一种新型相互激活机制介导的。然而，上游信号转导组件仍然难以捉摸。

磷酸磷脂酰肌醇（PIPs）是在真核细胞膜中发现的必需磷脂，是各种细胞过程中膜蛋白的关键调节因子，包括自噬。PIPs 由磷脂酰肌醇（PI）的第3、第4 和第5 位磷酸化产生，有7 种不同的 PIPs 衍生物。在第三位磷酸化的 PIPs [PI（3）P、PI（3,5）P2 和 PI（3,4,5）P3] 参与自噬诱导和吞噬泡的形成。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）是一种可使PI环上第3 位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，其结构可分为3 种类型（I 类、II 类和 III 类）。研究表明，I 类 PI3K 调节 AKT 和 SMAD2/3 信号，并促进剪切应力诱导的 SC 细胞自噬。

最近，在美国杜克大学眼科中心及斯坦福大学医学院眼科团队的一项研究中，探索了 PI3Ks 和 PIPs 作为上游信号成分在机械拉伸的 HTM 细胞中 PC 依赖性自噬激活中的作用，研究首次报道了 PIK3CA-INPP4A/B 参与机械应力下的自噬激活以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。研究成果发表于 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊题为“Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells”。

为了研究 I 类 PI3Ks 是否构成响应机械拉伸 TM 细胞中介导自噬激活的上游成分，首先分析了 PI3K 家族所有不同成员的催化亚基的 mRNA 表达水平。利用针对流出通道的单细胞 RNA 测序数据库的数据，发现 TM 细胞中 PI3Ks 催化亚基的 5 种亚型在 mRNA 水平上显著表达：IA 类 [PIK3CA（11.82%）、B（5.76%）和 D （3.75%）]、II 类 [PIK3C2A（18.59%）] 和 III 类 [PIK3C3（14.27%）]。

使用 PIK-75 对 I 类 PI3Ks 进行药理学抑制，浓度递增的 PIK-75（20 nM-2 μM）处理 HTM 细胞，随后应用循环机械拉伸（CMS，20% 或 8%应变，1 Hz）。2 μM 的 PIK-75 处理完全降低了 CMS 诱导的 LC3 II 水平升高（图1 A）。

最近一项关于造血干细胞的研究表明，PIK3CA、B 和 D 一起缺失，而不是单独或成对缺失，会破坏自噬。为了研究这种可能性，使用针对 PIK3CA、B 和 D 的 siRNA 对 IA 类 PI3Ks 的催化亚基进行单次或三次敲低，并评估机械拉伸细胞中的 LC3 II 水平。WB 分析显示，与对照细胞相比，经三重敲低的细胞中 CMS 诱导的 LC3 II 显著降低（图1 B）。与先前在造血干细胞中的发现一致，每个基因的单次敲除并不能阻止CMS诱导的LC3 II水平增加。

进一步研究证实，在用表达 RFP-GFP-LC3（Ad-tfLC3）的腺病毒转导的 HTM 细胞中抑制 I 类 PI3Ks 可防止 CMS 诱导的自噬体形成。与之前的研究一致，在 2 μM PIK-75 处理的CMS 刺激细胞中观察到自噬数据（自噬体：黄色点；自噬溶酶体：红色点）有质的增加（图1 C）。这些发现表明，I 类 PI3K 催化亚基通过促进自噬体的形成在调节 CMS 诱导的自噬中发挥作用。

图1 抑制 IA 类 PI3Ks 可防止 CMS 诱导的 HTM 细胞自噬。

接下来，研究了 II 类和 III 类 PI3K 是否也有助于 TM 细胞中拉伸诱导的自噬激活。为此，沉默了 HTM 细胞中 PIK3C2A 的表达，并评估了 CMS 后的 LC3 II 水平，发现PIK3C2A敲低并不能阻止CMS 作用下TM 细胞中 LC3 II 的增加。此外，III 类 PI3K（PIK3C3）的敲低并未抑制 CMS 诱导的 TM 细胞自噬激活。这些结果表明，II 类 PI3Ks 和 III 类 PI3Ks 均未显著促进 TM 细胞中拉伸诱导的自噬激活。

进一步研究 I 类 PI3Ks 在 HTM 细胞中 PC 上的定位。研究人员专注于 IA 类 PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3D），因为它们是 TM 细胞中表达最强烈的亚型。使用针对每种 I 类 PI3K 亚型的催化亚基的抗体以及乙酰化 TUBA4A（Ac-TUBA4A（一种 PC 标志物）进行免疫共染色。结果显示，PIK3CB 或 PIK3CD 在 PC 上没有显著的共定位。相比之下，PIK3CA 与 PC 表现出很强的共定位性（图2 A）。有趣的是，在暴露于循环机械拉伸的细胞中，PC 上 PIK3CA 的强度水平显著降低（图2 B）。这些结果表明，PIK3CA 定位于 PC 上，并在 CMS 处理的 HTM 细胞中与 PC 解离。

图2 PIK3CA 在 PC 上的定位及其在CMS 处理的 HTM 细胞中与 PC 的解离。

上述结果表明，I 类 PI3Ks 在 CMS 诱导的自噬中的作用。据报道，I 类 PI3Ks 与 PI 磷酸酶活性相结合，为 T 细胞中自噬的启动提供 PI（3）P。因此，研究了由 I 类 PI3Ks 和 PI 磷酸酶产生的 PI（3）P 是否参与 CMS 诱导的 TM 细胞自噬。

首先，研究了 I 类 PI3Ks 参与 PC 的 PI（3）P 产生情况。为此，敲低所有三种 IA 类 PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3CD）的表达，并对 PI（3）P 和 PC 标志物 ARL13B 进行共免疫染色，发现在 PC 和胞质囊泡内观察到 PI（3）P 染色（图3 A）。正如预期的那样，I 类 PI3K 活性降低的细胞表现出 PI（3）P 染色的整体降低。定量分析证实，在 I 类 PI3K 敲低后，PC 处的 PI（3）P 水平显著降低，支持 I 类 PI3Ks 在纤毛 PI（3）P 产生中的作用（图3 B）。值得注意的是，在机械拉伸的细胞中未观察到 PC 上 PI（3）P 产生的显著差异。

图3 PIK3CA、B 和 D 的三重敲低降低了 HTM 细胞中 PC 上 PI（3）P 的强度。

I 类 PI3Ks 主要产生 PI（3,4）P2 和 PIP3，然后转化为 PI（3）P。PI（3,4）P2 和 PIP3 都与 AKT 的普列克底物蛋白同源（PH）结构域结合。为了检测 PI（3,4）P2 或 PIP3，使用生物传感器质粒AKT-PH-GFP 转染 HTM 细胞并进行 CMS 处理。有趣的是，共聚焦显微镜显示在质膜上检测到 AKT-PH-GFP 信号，并在细胞内囊泡中积累（图4 A）。响应 CMS 后，每个细胞的 AKT-PH-GFP 阳性囊泡数量显著增加（图4 A）。共免疫染色进一步揭示了这些囊泡与网格蛋白重链（CLTC）的部分共定位（图4 B），表明囊泡是通过网格蛋白介导的内吞过程形成的。

最后，实验旨在确定 I 类 PI3K（PIP3 或 PI（3,4）P2）产生的哪些 PIPs 转化为 PI（3）P 以在 CMS 下启动吞噬泡的形成，以及与之相关的磷酸酶。为此，使用 siRNA 对 SHIP1 和 SHIP2（介导 PIP3 转化为 PI（3,4）P2的5’ PI 磷酸酶）或 INPP4A 和 INPP4B（介导 PI（3,4）P2 转化为 PI（3）P的 4' PI 磷酸酶）进行了双重敲低，并进行 CMS 测量 LC3 II 水平。结果显示，敲低 INPP4A/B ，但不是 SHIP1/2，显著降低了 TM 细胞中 CMS 诱导的 LC3 II 增加（图4 C）。此外，使用 AS1949490 对 SHIP1/2 进行化学抑制，在浓度递增的情况下，并没有降低 CMS 诱导的 LC3 II 水平。共定位研究 AKT-PH-GFP 和 LC3 标记点之间的部分共定位或接触，表明 I 类 PI3Ks 产生的 PIPs 可能有助于自噬体的生物发生。这些发现表明，I 类 PI3Ks 与 INPP4 磷酸酶一起在 CMS 诱导的TM 细胞自噬中起直接作用。

图4 在 HTM 细胞 CMS 期间 PI（3,4）P2 阳性囊泡对自噬的调节。

总之，该研究首次描述了 PIK3CA-INPP4A/B 在机械应力下自噬激活中的作用以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。未来需要进一步的研究来了解哪些 IA 类 PI3Ks 调节自噬降解的机制，以及通过机械力调节 IA 类 PI3K 激活的上游信号。在 TM 机械感觉中具有已知功能的强候选者是整合素和 G 蛋白偶联受体（GPCRs）。了解青光眼中的这些通路及其潜在改变，包括 I 类 PI3K 的改变，可以提供新的治疗策略来恢复 IOP 稳态。

参考文献：Shim MS, Sim EJ, Betsch K, Desikan V, Su CC, Pastor-Valverde D, Sun Y, Liton PB. Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells. Cell Mol Life Sci. 2025 Feb 22;82(1):82. doi: 10.1007/s00018-025-05615-x. PMID: 39985671; PMCID: PMC11846827.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39985671/

Journal Impact Factor 6.2 (2023)

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