Overexpression of pressure-responsive miRNA-5703 inhibits pressure-induced growth and metastasis of liver cancer

Keywords: liver cancer; metastasis; miRNA-5703; portal hypertension; pressure; proliferation.

肝癌是全球癌症相关死亡第三大原因，男女死亡率合计 8.2% 。免疫抑制剂治疗肝癌反应率低，肿瘤微环境是关键干扰因素，其中物理线索作用未明。门静脉高压症（PHTN）是肝癌公认危险因素与独立预测因子，会增加肝窦生物压力，破坏肿瘤微环境机械平衡，但其调节肝癌细胞增殖和转移机制不明。压力影响实体瘤生长侵袭，此前研究心血管和骨科疾病中机械响应 miRNAs ，肝癌中压力反应 miRNA 功能待探索。SRC 自磷酸化等信号通路与癌症进展转移相关。前期研究发现 15 mmHg 压力作用 24 小时可促进肝癌细胞系增殖、迁移和侵袭，筛选出相关 miRNAs 和mRNA 。基于此，南京大学金陵医院消化内肝病科的研究团队通过体内外实验探究压力反应 miRNA - 5703 在肝癌生长和转移中的作用及机制，发现其过表达或抑制肝癌机械依赖性发展，为其与免疫抑制剂联合应用提供理论基础。研究成果发表在Journal of Cancer 期刊，题为“Overexpression of pressure-responsive miRNA-5703 inhibits pressure-induced growth and metastasis of liver cancer”。


首先，使用 MicroDB、MicroTarBase 和 TargetScan 三个网站，对通过 miRNA 微阵列鉴定出的五个压力敏感型 miRNA（miRNA-5703、miRNA-630、miRNA-7641、miRNA-7-5p 和 miRNA-4485-3p）的靶基因进行预测，分别得到 1213、10679 和 1222 个靶基因（图 1A）。综合共 11526 个基因，其中 1309 个与通过 mRNA 微阵列鉴定出的差异表达 mRNA 相对应（图 1B），且差异表达的预测靶基因中有 SRC 基因。

对这 1309 个靶基因进行 KEGG 通路分析，发现与癌症生长和转移相关的前三条通路为FA通路、PI3K 通路和 FOXO 通路（图 1C），且这三条通路共同上游基因为 SRC，也是在压力负荷下表达下调的 miRNA-5703 的预测靶基因之一。

使用 mRNA 微阵列检测对照组（培养 24 小时的 HepG2 细胞）和压力处理组（15 mmHg 压力下处理 24 小时的细胞）的变化，得到与三条通路相关的差异表达基因聚类热图（图 1D），显示 PTK2、PI3K、PIK3R1、SRC 和 SGK3 在受压肝癌细胞中表达上调，FOXO1、CDKN1B、P27Kip1 表达下调，PDK1 表达无显著变化，且通过 RT-qPCR 在 HepG2 和 Huh-7 细胞系中验证了这些基因表达（P < 0.05 或 P < 0.01） 。
 

图1 压力诱导信号通路的预测。

随后，通过 miRNA 芯片和 mRNA 微阵列检测发现，受压 HepG2 细胞中 miRNA - 5703 表达下调约 0.68 倍（图 1F），SRC 表达上调约 8.87 倍（图 1G）。利用 RT - qPCR 在 HepG2、Huh - 7 和 MHCC97H 三种肝癌细胞系中验证了该芯片结果（图 2A，P <0.05，P < 0.01 或 P < 0.001；图 2B，P < 0.05），而在正常肝细胞系 HL - 7702 中，miRNA - 5703 和 SRC 的表达无显著变化（图 2A，P> 0.05；图 2B，P > 0.05）。

Western blotting 表明，miRNA - 5703 过表达可抑制 HepG2 和 Huh - 7 细胞中 SRC 的表达（图 2C 和 2D，P <0.05）。利用 TargetScan 网站预测出 miRNA - 5703 在 SRC 3' 非翻译区第 1745 - 1751 位核苷酸的 7mer - m8 型结合位点（图 2E）。通过将野生型和突变型质粒转染至 HEK293T 细胞并检测荧光素酶信号比值，在 SRC 中野生型结合位点的 miRNA - 5703 过表达后，该比值降低了 43.69%（图 2F，P < 0.001），而结合位点突变后 miRNA - 5703 过表达前后该比值没有显著差异（图 2F，P> 0.05）。

研究收集不同巴塞罗那临床肝癌分期（BCLC）患者的肝癌及癌旁正常组织样本，对比发现：与 BCLC A1 期（无门静脉高压，PHTN）患者相比，A2 - D 期（有门静脉高压）患者的肝癌组织中，miR - 5703 表达被抑制（图2G，P <0.05），SRC 的 mRNA 水平更高（图2I，P < 0.05） ，且这一差异在癌旁正常组织中不显著（图 2H和2J,P > 0.05)。进一步分析配对组织发现，A1 期和 A2 - D 期多数患者的肝癌组织中 SRC 表达高于癌旁正常组织，其中相当比例患者肝癌组织的 SRC 呈高表达（> 2 倍）（图2K和2L）。

 图2 验证 SRC 作为 miRNA-5703 的靶基因。

为了研究 HepG2 和 Huh-7 细胞系的增殖情况，采用流式细胞术进行检测检测。结果发现，miRNA-5703 过表达显著降低 HepG2 和 Huh-7 细胞处于 S 期的比例，敲低 SRC 也有类似效果。将 HepG2 和 Huh-7 细胞分组处理后，CCK-8 法检测显示，miRNA-5703 过表达及敲低 SRC 均能显著抑制肝癌细胞增殖，而对于受压的正常肝细胞系 HL-7702 细胞，其生长不受影响（图3）。

图3 miRNA-5703 的过表达抑制了压力诱导的肝癌细胞增殖。

研究压力对SRC-FAK-FOXO1 信号通路诱导细胞增殖的影响。结果发现15 mmHg压力负荷促进肝癌细胞中 SRC、FAK、PI3K、SGK3 表达，抑制 FOXO1 和 P27Kip1 表达（图4）。且使 pSRC、pFAK、pPDK1、pSGK3 表达上调，说明压力不仅 在mRNA 水平上增加影响相关基因转录，还激活蛋白磷酸化，同时 PDK1 的 mRNA 表达不受压力调控但蛋白可被磷酸化。对受压细胞分别用赫比霉素 A（pSRC 抑制剂）、Gsk2256098（pFAK 抑制剂）、LY294002（PI3K 抑制剂）、PHT-427（PDK1 抑制剂）和 EMD638683（SGK3 抑制剂）进行处理并检测级联反应中上下游蛋白关系。此外，miRNA-5703 过表达或 SRC 敲低会抑制下游蛋白表达，揭示了 miRNA-5703 抑制肿瘤生长的机制（图5）。

图4 压力通过 SRC-FAK-FOXO1 信号通路诱导细胞增殖。

图5 miRNA-5703 的过表达以及 SRC 基因的沉默逆转了压力负荷在特定细胞中所诱导产生的增殖效应。

接下来，研究miRNA-5703 过表达对压力诱导的肝癌细胞迁移和侵袭的影响。研究将 HepG2 和 Huh-7 细胞系依条件分为对照组、压力组、压力 + miRNA-5703（+）组、压力 + SRC（-）组。细胞划痕实验显示，miRNA-5703 过表达和 SRC 基因敲低均能抑制 HepG2 和 Huh-7 细胞迁移（图6A）；Transwell 小室实验表明，miRNA-5703 过表达显著抑制 HepG2 和 Huh-7 细胞侵袭，SRC 基因敲低对肝癌细胞增殖有类似抑制效果（图6B），而压力对 HL-7702 细胞迁移无显著影响（图6C）。

图6 miRNA-5703 的过表达抑制了压力诱导的肝癌细胞的迁移和侵袭。

外周膜蛋白 GM130 与高尔基体膜紧密相连，参与细胞极化和定向迁移调控。免疫荧光测定显示，HepG2、Huh-7 和 HL-7702 细胞中 GM130 表达增加（图7A)。细胞黏附实验表明，压力负荷下 HepG2、Huh-7 和 MHCC97H 细胞系黏附于基质的细胞数量显著增多（图7B)。

图7 压力负荷对肝癌及正常肝细胞黏附与 GM130 表达的影响。

通过幽灵铅笔环肽染色发现，压力增加 HepG2 和 Huh-7 细胞的细胞骨架微丝数量，而 miRNA-5703 过表达显著减少其数量；免疫荧光显示，压力上调黏着斑蛋白纽蛋白表达，miRNA-5703 过表达则显著抑制受压细胞中纽蛋白的表达（图8）。

图8 miRNA-5703 对肝癌细胞微丝及黏着斑蛋白表达的调控。

15 mmHg压力下，赫比霉素 A 和 GSK2256098 抑制 HepG2 和 Huh-7 细胞中 paxillin 表达，另三种抑制剂无显著影响， 这表明 15 mmHg的压力负荷促进了 HepG2 和 Huh-7 细胞中 SRC 和 FAK 的表达，并且显著上调了 paxillin 的表达。miRNA-5703 过表达或 SRC 敲低可抑制paxillin 表达，表明这可能是 miRNA-5703 抑制肿瘤转移的机制（图9）。

图9 miRNA-5703 的过表达通过 SRC-paxillin 通路抑制压力诱导的细胞增殖。

最后，实验将 MHCC97H 细胞依条件分四组：对照组、压力组、压力 + 载体组、压力 + miRNA-5703（+），将这些细胞皮下注射到小鼠后 10 天成像显示，受压细胞组肿瘤大小和重量增加，miRNA-5703 过表达组减小（图 10A）；肝癌和正常肝组织 HE 染色如图 10B；蛋白免疫印迹表明，miRNA-5703 过表达组中，压力上调的 SRC 表达受抑制（图10C）。
 

图10 在裸鼠中验证了压力对肝癌生长和转移的影响。

免疫组化检测表明，压力处理组肿瘤中 Ki67 表达上调、NM23 表达下调，miRNA - 5703 过表达组则相反（图10D）。Ki67 与细胞增殖和有丝分裂相关，NM23 可抑制肿瘤转移，两者在临床肿瘤检测中意义重大。通过 RT - qPCR 评估四组肿瘤中 miRNA - 5703 表达（图10E），级联反应示意图11所示。

图11 压力响应性 miRNA-5703 通过抑制 SRC 表达来促进肝癌生长和转移的示意图。

总之，该研究表明miRNA-5703 的上调通过抑制 SRC-FAK-FOXO1 轴和 SRC-paxillin 轴来抑制压力诱导的肝癌生长和转移 ，有助于研发受力学启发的肝癌抗癌药物。

参考文献：Shen S, Zhou W, Xuan J, Xu W, Xu H, Yang M, Zhu L, Yang Z, Yang B, Shi B, Zhao Y, Wang F. Overexpression of pressure-responsive miRNA-5703 inhibits pressure-induced growth and metastasis of liver cancer. J Cancer. 2022 Jan 1;13(1):325-342. doi: 10.7150/jca.64926. PMID: 34976193; PMCID: PMC8692678.

原文链接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8692678/

Impact Factor: 3.3

ISSN: 1837-9664

图片来源： 所有图片均来源于参考文献

小编旨在分享、学习、交流生物科学等领域的研究进展。如有侵权或引文不当请联系小编修正。如有任何的想法以及建议，欢迎联系小编。感谢各位的浏览以及关注！进入官网www.naturethink.com或关注“Naturethink”公众号，了解更多相关内容。

点击了解：细胞压力培养仪