在结构生物学、功能蛋白质组学和生物制药等领域，获取大量高纯度、正确折叠的重组蛋白是开展深入研究或应用的前提。然而，传统蛋白纯化方法步骤繁琐、效率低且易损伤蛋白活性。亲和标签融合技术的出现为这一难题提供了高效解决方案：通过基因工程手段，将一段对特定配基具有高亲和力的氨基酸序列（亲和标签）与目标蛋白融合表达，利用基于生物分子特异性识别（如抗原-抗体、酶-底物、受体-配体）的亲和层析技术，可在温和条件下实现目标蛋白的一步高效纯化。

• 结合特异性高：标签只与特定的配基（固定在层析介质上的分子）强力结合，大大减少杂质干扰。
• 纯化条件温和：通常在中性pH、接近生理条件的缓冲液中进行，最大程度保护蛋白活性。
• 操作简便高效：通常只需一步亲和层析即可达到较高的纯度，显著简化流程。

• 提高蛋白产量

促进翻译起始：位于N端的某些标签（如GST、MBP、SUMO）能为核糖体提供高效的起始位点，显著提升蛋白表达水平。

抗宿主蛋白酶降解：一些标签能保护融合蛋白免受宿主细胞内蛋白酶的降解，增加稳定积累量。

• 增强蛋白可溶性

解决包涵体难题：在大肠杆菌中过表达外源蛋白，超过一半会形成不溶性的包涵体。高度可溶的标签（如MBP, NusA, GST, SUMO, Trx）能有效带动融合蛋白以可溶形式存在。

机制原理:

1. “分子伴侣”模型：标签（如MBP, NusA）可能具有内在的类分子伴侣活性，其疏水区与部分折叠的目标蛋白短暂相互作用，阻止错误聚集，引导正确折叠。
2. “隔离保护”模型：融合蛋白形成可溶的多聚体微结构，易聚集的目标蛋白被包裹在内受到保护，亲水的标签暴露在外维持溶解性。

• 促进正确折叠

虽然蛋白折叠主要取决于自身序列，但增溶标签（如MBP, NusA, Trx）能创造有利环境，协助目标蛋白形成正确的三维结构，减少错误折叠聚集。

机制原理：有观点认为标签是主动参与折叠（不同标签效果差异大），也有观点认为标签是被动提供保护（不同标签效果相似）。

根据大小和性质，主要分为短肽标签和蛋白标签：

短肽标签（Small Peptide Tags）：分子量小，通常对目标蛋白影响较小。

His-Tag（多聚组氨酸标签）

组成：最常用6个组氨酸（His6），也可5-15个。

纯化原理：组氨酸的咪唑环与二价金属离子（Ni²⁺, Co²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺）形成配位键。IMAC（固定化金属离子亲和层析）是其核心技术。

优点：

• 极小，几乎不影响蛋白结构、功能、溶解度和结晶。
• 兼容性强，适用于几乎所有表达系统（原核、真核、无细胞）。
• 纯化条件极宽泛：可在变性（尿素/盐酸胍）或非变性条件下进行纯化，对含有二硫键或膜蛋白特别有用。
• 树脂（如Ni-NTA）结合容量高（5-10 mg/ml）、成本相对低、可再生。

缺点：宿主蛋白中富含组氨酸/半胱氨酸的区域可能导致非特异性结合；不适合含金属辅基的目标蛋白。

FLAG-Tag

组成：8个氨基酸 (DYKDDDDK)

纯化原理：通过单克隆抗体（M1、M2、M5）进行免疫亲和层析。M2抗体应用最广，可识别N端或C端标签。

优点：

• 分子量小，亲水，不易遮盖蛋白表位或影响功能。
• 含有肠激酶切割位点（DDDK），便于标签去除。
• 常用合成FLAG短肽竞争洗脱，洗脱条件温和，利于保持蛋白活性。
• 也可用精氨酸在偏酸条件下进行洗脱，降低了纯化成本，简化了纯化步骤。

缺点：合成FLAG肽洗脱成本较高；抗体树脂载量较低（约0.6 mg/mL）。

3×FLAG-Tag

组成：三个FLAG标签串联，22个氨基酸（约2.7 kDa）。

优点：

• 保留了肠激酶切割位点和亲水性。
• 检测灵敏度比其他系统高20-200倍，适合低丰度蛋白检测。
• 优化接头设计后，在免疫沉淀纯化小分子活性蛋白时效果更佳。

Strep-tag II

组成：8个氨基酸（WSHPQFEK）

纯化原理：与工程化的链霉亲和素变体Strep-Tactin高亲和力结合，并使用脱硫生物素（Desthiobiotin）竞争洗脱。

优点：

• 可位于蛋白N端或C端，应用灵活。
• 纯化条件温和且兼容性好：允许存在螯合剂、去污剂、还原剂和高盐（高达1M）。
• 不依赖金属离子，适合纯化含金属离子的蛋白。
• Strep-Tactin树脂载量较高（约1.5 mg/mL）。

缺点：与天然链霉亲和素亲和力不够高（故需用Strep-Tactin）。

Strep-tag III

组成：两个Strep-tag II串联

优点：

• 可进一步提高结合亲和力。
• 用于哺乳动物细胞中蛋白质复合体的分离与鉴定，相关蛋白质复合体的检测灵敏度明显提升。

蛋白标签 (Protein Tags)：分子量较大，通常兼有增溶和提高产量的作用。

GST

大小：~26 kDa（211个氨基酸）

纯化原理：与固化的谷胱甘肽（GSH）结合，并使用还原型谷胱甘肽洗脱。

优点：

• 提供高效的翻译起始位点。
• 能显著提高融合蛋白可溶性和表达量（尤其在大肠杆菌中）。
• GSH树脂成本较低，载量较高（8-10 mg/mL）。

缺点：

• 易于形成同源二聚体，增加纯化复杂度，不适合多亚基复合物纯化。
• 大分子标签增加细胞代谢负担。
• 与谷胱甘肽琼脂糖树脂的结合速度较慢，大规模纯化耗时。
• 对大于80 kDa的大蛋白纯化回收率可能较低。
• 暴露的半胱氨酸可能导致氧化聚集。

MBP

大小：~40 kDa (396个氨基酸)。

纯化原理：与固化的直链淀粉结合，并使用麦芽糖洗脱。

优点：

• 是除GST外最有效的增溶标签之一，尤其适用于难溶蛋白。
• 能提高目标蛋白表达量。

缺点：作为亲和标签蛋白纯化效率不高，与直链淀粉树脂的结合特异性可能不够理想，纯化后纯度可能不足。

优化策略：在MBP和目标蛋白间加入柔性接头（如多聚天冬酰胺）可能改善结合效率；对MBP进行突变可调节其构象平衡和配基亲和力。

亲和标签技术自诞生以来，已成为重组蛋白研究不可或缺的工具。理想的标签应具备通用性强（适用于各种宿主/系统）、位置灵活、能改善表达（提高产量、溶解性、促进折叠）和便于检测等特性。德泰生物提供His/Flag/GST/Strep等标签的特异性抗体。产品特异性好、稀释度高、稳定性佳。同时进行了大量的验证工作，确保所有产品能够顺利的应用于下游应用。