想做细胞命运的相关研究，但谱系示踪的东西又繁琐又复杂？刚开始设计课题，已经被各类Cre/Dre工具鼠的介绍文献搞晕了，这该怎么办呢？别担心，本篇推文从实验设计思路开始，帮您梳理谱系示踪中各类工具的应用。

Step 1 了解谱系示踪是什么？
谱系示踪，通常是指使用各种手段对某类祖细胞亚群进行标记，在后续时间点对其分化命运进行检测。更通俗地说，我们需要给细胞加一个标记，这个标记可以伴随它的增殖分化（在我们的观察期内）一直延续下去。想要满足这个目的，我们就必须要使用Cre-loxP为代表的重组酶的标记方式。

想了解不同的标记方式的区别与应用？可点击下列链接详细了解
【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式

Step 2 使用重组酶的标记方式需要涉及哪些小鼠？
顾名思义，Cre-loxP系统分为两个部分：Cre酶与loxP位点。Cre酶调控相同的loxP（以及lox变体）位点进行重组，介导基因发生改变。相似的重组酶系统有：Dre酶与Rox位点、FLP酶与FRT位点。

想了解更详细的Cre-Loxp重组酶系统相关知识，可点击下列链接详细了解
小鼠大学问 | Cre-Lox系统核心原理全解析

那么在谱系示踪中，我们如何借助这个系统，合理设计小鼠进行科学研究呢？

重组酶小鼠

报告基因小鼠

Step 3 明确想标记的细胞所需的Marker
我们想要标记固定类型的细胞，最重要的就是了解这类细胞如何去准确定位，这一步需要大量查阅文献来确定。

如果我们研究的细胞群体拥有特异性的Marker，我们仅需1个Marker即可定位细胞，那我们即可进入基础模式。

标记目标细胞群需2个甚至以上的细胞marker（以2个为例，称为Marker A与Marker B），并且目标细胞群可能是A+B+，A-B+，A+B-等多种情况。

这种情况下，标记细胞群要精确，我们的组合搭配就要有考究，需要“基础款”与“高端款”相结合。

1“高端款”报告基因小鼠，搭配“基础款”重组酶小鼠

当我们选择使用A-Cre，B-Dre（或A-CreER，B-DreER）的基础款Cre小鼠后，为了满足我们精准标记的目的，我们可以选择以下三种“高端款”报告基因小鼠：
交叉报告基因系统：标记markerA+B+双阳性细胞，适用于双阳性细胞类型标记；
独家报告基因系统：标记markerA+B-细胞，有先后顺序，适用于A-CreER与B-Dre单个诱导性重组酶标记
嵌套报告基因系统：标记markerA+B-细胞，无先后顺序，适用于A-CreER与B-DreER多个诱导性重组酶标记
可点击链接了解各类系统详情

2“高端款”重组酶小鼠，搭配“基础款”报告基因小鼠

当我们选择使用LoxP-Stop-LoxP-reporter的基础款报告基因小鼠时，为满足我们的标记需求，重组酶小鼠也可以被设计为“高端款”：
roxCre：将 rox-Stop-rox（RSR）插入 Cre编码区，适用于双阳性细胞类型标记。（loxDre同理）
CrexER：将 rox 位点插入到 CreER的ER区的两侧，适用于双阳性细胞类型标记。（DrexER同理）
dCreER：将 rox 位点插入到 CreER 整体编码区的两侧，适用于已知阳性&阴性marker细胞标记。（dDreER同理）

想了解更详细的重组酶改造相关知识，可点击下列链接详细了解
谱系示踪的难点——基因标记的异位表达如何避免？（下）

3双“高端款”联手组合
上面讲述了两种“高端款”小鼠和“基础款”小鼠搭配的情况，那么“高端款”重组酶小鼠是否能搭配“高端款”报告基因小鼠呢？

以嵌套报告小鼠与loxDre小鼠联用为例，我们使用A-CreER小鼠、B-loxDre小鼠、NR1小鼠进行交配。理论上，该小鼠无tamoxifen诱导时，无细胞被标记；在tamoxifen诱导后，A+细胞会被标记为绿色，而在诱导以后，A+细胞中表达B的细胞才会被标记为红色。

通过两种高端款的连用，在AB表达时间层面精确的标记了目的细胞。

转移的肿瘤细胞是否发生上皮细胞向间充质细胞的转换（epithelial-mesenchymal transition, EMT）一直是肿瘤研究领域的一大热点。前期的研究利用体外细胞培养以及移植的方法认为EMT过程对于肿瘤细胞的转移具有重要的作用，但缺乏直接的体内实验证据。

肿瘤模型中瞬时的、可逆的EMT过程很难用单重组酶系统精准的捕捉到。因此，周斌研究组科研人员选择使用roxCre的相似改造思路，构建了loxDre重组酶，并利用双重组酶报告基因小鼠中的嵌套报告基因小鼠，尝试捕捉瞬间的EMT画面。

实验设计如下：科研人员选择在自发性乳腺癌肿瘤模型小鼠MMTV-PyMT的背景上，利用Kit-CreER来标记小鼠乳腺管腔上皮细胞。利用一些间充质细胞的分子标记（例如Vimentin和N-cadherin）作为发生EMT的Marker，构建了基因敲入小鼠EMTgene-LSL-Dre（N-Cad-LSL-Dre和Vim-LSL-Dre）。将以上几种重组酶小鼠与双重组酶报告基因小鼠NR1交配获得EMTracer系统来同时示踪发生过和未发生过EMT的乳腺肿瘤细胞。

图. EMTracer系统的基因重组图解^[1]

1. Kit-CreER与报告基因NR1的LoxP发生重组，使Kit+的乳腺管腔上皮细胞被标记上绿色荧光蛋白（ZsGreen）。
2. Kit-CreER与EMTgene-LSL-Dre的LoxP发生重组，使介于两个LoxP之间的stop序列被切掉，当发生上皮细胞向间充质细胞的转换后，EMTgene就会启动表达。
3. EMTgene后面的Dre表达出来，与报告基因NR1的Rox发生同源重组，使报告基因NR1位于两个Rox位点之间的Rox-LoxP-stop-LoxP-ZsGreen-PolyA-Rox序列被切掉，使发生过EMT的细胞由之前的绿色荧光蛋白（ZsGreen）转变成红色荧光蛋白（tdTomato)，实现对EMT的监测。

利用两种基因（Vimentin和N-cadherin）构建两套EMTracer系统进行对比，可以发现发生转移的细胞群中，采用Vim-EMTracer系统系统标记的细胞呈现绿色，而采用N-cad-EMTracer系统系统标记的细胞呈现红色，说明该乳腺癌转移发生EMT是N-Cadherin依赖性的。

图. 基因Vimentin和N-cadherin构建两套EMTracer系统的结果图解^[1]

成功完成以上步骤，恭喜你，你已成为谱系示踪标记大师了！接下来就是根据课题研究的实际情况，购买定制合适的小鼠进行繁育。这时候，如果有现成的Cre鼠工具库就是帮大忙了！

Key Step
查询南模生物Find Cre^®数据库

南模生物深耕基因修饰动物模型行业二十余年，为快速精准地选择合适Cre工具鼠，特推出Find Cre^®数据库。该数据库包含600多种自主产权Cre/Dre重组酶工具鼠，以小鼠组织、器官和系统为主线，可分为肺、肝、胃肠道、乳腺、胰腺、感觉器官、心血管系统、免疫系统、神经系统、泌尿生殖系统、骨骼肌系统以及其他组织器官。大家若有相关需求，可以点击这里进入Find Cre^®数据库，查询可用的工具鼠。

Reference：
[1] Genetic Fate Mapping of Transient Cell Fate Reveals N-Cadherin Activity and Function in Tumor Metastasis Li, Yan et al.Developmental Cell, Volume 54, Issue 5, 593 - 607.e5

关于我们
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。