2026年3月6日，四川大学丁楅森/曹中炜等联合中国医学科学院北京协和医学院王辰院士等在Cell发表题为“Selective targeting of endothelial and perivascular angiocrine ROCK2 treats liver fibrosis”的研究论文。该论文揭示血管内皮细胞及血管周围HSC中异常上调的ROCK2在肝纤维化进展中的致病作用，明确血管微环境在纤维化持续演进中的重要调控作用，并系统阐述“血管旁分泌”（Angiocrine）信号在疾病进程中的驱动功能。并基于ROCK2靶点开展药物设计与筛选，获得高选择性ROCK2抑制剂TDI01。该工作构建了从靶点发现-药物研发-临床研究的first-in-class新药开发全链条，为靶向血管Angiocrine功能的抗纤维化治疗提供了理论依据与实践基础。

南模生物为该研究提供了Vav1-2A-Cre mice（目录号：NM-KI-233228）及Lrat-2A-Cre mice（目录号：NM-KI-190097）小鼠模型。

肝脏在损伤后会进行自我修复，肝再生需要不同细胞类型之间的协调交互。在此过程中，异常激活的肝星状细胞（HSCs）分化为肌成纤维细胞，导致肝纤维化。肝纤维化不仅是多种慢性肝病（如代谢功能障碍相关脂肪性肝炎MASH）的共同组织学特征，更是其向肝硬化乃至肝癌进展的关键病理基础。尽管目前已有一系列抗纤维化候选药物进入临床试验，但临床可用的有效治疗手段仍然极为有限。因此，鉴定肝纤维化进程中关键且可成药的致纤维化分子，已成为该领域亟待解决的核心问题。

HSC的活化受其周围细胞的调节，研究表明，免疫细胞可与HSCs相互作用，促进肝纤维化。基于此，越来越多的治疗候选药物已在伴纤维化的MASH患者临床试验中接受测试。例如，代谢调节剂展现出积极疗效，甲状腺激素受体-β（THR）激动剂瑞美替罗和胰高血糖素样肽-1（GLP1）受体激动剂司美格鲁肽已相继获批；此外，丝裂原活化蛋白激酶激酶4（MKK4）抑制剂在临床前模型中也被证实可促进肝再生。然而，能有效逆转患者肝纤维化的疗法极为有限。然而，上述疗法在逆转已形成的肝纤维化方面效果仍不理想，而靶向特定致纤维化分子（如赖氨酰氧化酶样蛋白2，LOXL2）的干预策略亦未在临床研究中取得预期成功。因此，开发基于机制的治疗药物是肝脏疾病抗纤维化治疗的迫切需求。

基于上述问题，研究团队进行了以下研究：
1 ROCK2在人纤维化肝脏的血管中上调
为探究ROCK2在纤维化肝脏中的表达模式及其细胞特异性，研究团队首先对公开的人肝脏转录组数据集（GEO：GSE193066和GSE173735）进行了通路富集分析。结果表明，纤维化肝脏中显著富集了"Rho GTPase循环"及其效应器相关信号（图1A）。Rho GTP酶效应分子及Rho GTP酶循环均与ROCK家族相关，该家族是设计激酶抑制剂的理想药物靶点（图1B）。基于此，团队进一步通过scRNA-seq技术对人肝脏中ROCK1和ROCK2的表达进行了分析。结果显示，与广泛表达的ROCK1不同，ROCK2在肝脏内皮细胞（ECs）和肝星状细胞（HSCs）中呈现优先表达，且在纤维化肝脏中表达显著上调（图1C-E）。为在蛋白水平验证这一发现，研究团队对人肝组织切片进行了多重免疫荧光染色。结果显示，ROCK2及其磷酸化活化形式（pROCK2）在纤维化肝脏的LYVE1⁺ 肝窦内皮细胞（LSECs）和desmin⁺ HSCs中呈分期依赖性高表达（图1F-I）。相反，在CD45⁺ 造血细胞和HNF4α⁺ 肝细胞中，ROCK2的表达水平极低且无显著变化（图1J-K）。以上数据表明，ROCK2在纤维化肝脏的血管内皮细胞及血管周围HSCs中选择性上调，提示其作为抗纤维化干预靶点的潜力（图1L）。
 

图1. 人类纤维化肝脏中血管内皮细胞及血管周围肝星状细胞中ROCK2的表达上调

2 ECs和HSCs中的ROCK2在小鼠模型中促进肝纤维化
为明确ROCK2在肝纤维化进程中的功能细胞来源，研究团队构建了内皮细胞（EC）特异性诱导型ROCK2基因敲除小鼠（Rock2^iΔEC/iΔEC），并利用CCl₄诱导的肝纤维化模型进行验证（图2A）。结果显示，与对照小鼠相比，Rock2^iΔEC/iΔEC小鼠的肝胶原沉积显著减少，血清转氨酶（ALT、AST）及肝羟脯氨酸（HYP）水平均明显下降（图2B-E），提示内皮细胞中ROCK2上调是驱动损伤后肝纤维化的重要因素。

进一步，研究团队利用HSC特异性Lrat-Cre小鼠构建了HSC中ROCK2缺失的小鼠（Rock2^ΔHSC/ΔHSC），并利用CCl₄诱导的肝纤维化模型（图2F）。结果表明，在相同纤维化模型中，Rock2^ΔHSC/ΔHSC小鼠同样表现出纤维化程度减轻，但改善幅度低于内皮细胞特异性敲除小鼠（图2G-J）。在MASH模型中，研究团队进一步验证了上述发现。结果显示，内皮细胞或HSCs中ROCK2的缺失均可显著减轻肝纤维化、改善肝脂肪变性并降低血清转氨酶水平（图2K-V）。以上数据表明，ROCK2在内皮细胞及HSCs中的上调是驱动肝纤维化进展的关键机制，靶向该分子的激酶活性有望成为抗纤维化治疗的策略。
 

图2. ECs和HSCs中ROCK2基因缺失可减轻肝纤维化和肝损伤

3 TDI01被鉴定为ROCK2选择性抑制剂
为获得具有临床应用潜力的ROCK2选择性抑制剂，研究团队基于ROCK2晶体结构及已知抑制剂骨架，通过计算机辅助药物设计（CADD）合成686种候选化合物，并建立了一套多级筛选流程（图3A）。首先，采用均相时间分辨荧光（HTRF）技术来鉴定特异性抑制ROCK2活性但不抑制ROCK1的化合物。初筛结果显示，126个化合物可显著抑制ROCK2活性，其中47个化合物对ROCK2的半数抑制浓度（IC₅₀）低于45 nM（图3B）。进一步以ROCK1/ROCK2 IC₅₀比值大于200为标准筛选高选择性抑制剂，共获得41个符合要求的化合物（图3C）。

综合两项指标，共有37个化合物同时满足强效（ROCK2 IC₅₀ < 45 nM）与高选择性（选择性指数 > 200）标准，进入后续药代动力学（PK）筛选（图3D）。结果显示，剂8个ROCK2选择性抑制剂具有良好暴露量（图3E）。随后，采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及肝窦内皮细胞（LSECs）对上述8个化合物进行细胞毒性评估，仅TDI01470在两种细胞中的IC₅₀均高于20 μM，提示其细胞毒性较低（图3F）。hERG心脏毒性试验进一步证实，相较于阳性对照多非利特（Dofetilide），TDI01470表现出最小的心脏毒性（图3G）。大鼠PK研究也同样表明，TDI01470口服生物利用度达56%，半衰期（T_1/2）为3.2h，暴露量呈剂量依赖性（图3H）。

综合上述筛选结果，TDI01470被确定为最终候选化合物，并命名为TDI01。激酶活性测定显示，TDI01对ROCK2的IC₅₀为10.31 nM，对ROCK1的IC₅₀为6,159 nM，选择性指数达598倍（图3I），表明其具有高度ROCK2选择性抑制活性。

图3. 具有最佳药代动力学参数和安全性的ROCK2选择性抑制剂TDI01的鉴定

4 TDI01可直接与ROCK2结合并发挥其抑制作用
为确证TDI01与ROCK2的直接结合及其机制，研究团队开展了一系列分子互作与结构研究。生物层干涉（BLI）结果显示，TDI01与ROCK2激酶结构域（KD）呈高亲和力结合（KD=65.56 nM），而与ROCK1在浓度高达60 μM时仍无显著结合（图4A-B）。进一步利用生物素标记的TDI01在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及肝星状细胞LX2一起孵育，对pulled down的细胞裂解物进行定量蛋白质组学分析显示，ROCK2是与生物素-TDI01结合强度最高的靶蛋白（图4C-D）。功能实验显示，TDI01在细胞中表现出对ROCK2活性的剂量依赖性抑制（图4E-F）。

为阐明TDI01的结合模式和抑制机制，研究团队利用冷冻电镜解析了ROCK2 KD与TDI01复合物的三维结构。结果显示，TDI01结合于ROCK2的ATP结合口袋，诱导其采取激酶非活性状态的"DFG-out"构象，而ROCK1因F194残基的空间位阻无法发生该构象变化（图4G-J）。关键残基L210在TDI01选择性识别中起决定性作用：L210F点突变完全消除了TDI01与ROCK2的结合及其抑制活性（图4K-O）。以上结果表明，TDI01通过与ROCK2的L210残基特异性结合，将其锁定于非活性构象，从而实现高选择性抑制。

图4. TDI01作为ROCK2选择性抑制剂的特性研究
 

图5. TDI01在模拟人类病理学的迷你猪MASH模型中减轻纤维化

6 TDI01在人体中的1期临床试验
为评估TDI01在人体中的安全性、耐受性及药代动力学（PK）特征，研究团队开展了一项随机、双盲、安慰剂对照的1期临床试验。共入组62例健康志愿者，分别接受单次递增剂量（400、800、1200 mg）、多次给药（200、400 mg，每日一次，连续7天）及食物影响评估。结果显示，TDI01在所有剂量组均表现出良好的安全性，未发生严重不良事件。PK分析显示，TDI01口服后吸收迅速，单次给药后血浆浓度呈双相曲线，达峰时间（Tmax）约为4小时，半衰期（T_1/2）约8-13小时，暴露量（Cmax和AUC）呈剂量依赖性增加。多次给药3-4天后达到稳态，蓄积系数合理（Rac 1.68-2.39），表明每日一次给药方案可行。食物影响研究表明，高脂餐延迟TDI01吸收（Tmax延长至7.1小时），但显著提高暴露量（Cmax和AUC增加），提示餐后给药可增强生物利用度。以上结果表明，TDI01在健康志愿者中具有良好的安全性和可预测的PK特征，支持其在肝纤维化患者中的后续临床研究。

7 临床研究表明TDI01有减轻患者肝纤维化的趋势
为初步评估TDI01在肝纤维化患者中的安全性与疗效，研究团队开展了一项剂量递增的扩展临床研究。该研究设计为剂量递增试验，包括一个初始低剂量队列（200 mg），随后递增到高剂量队列（400 mg）。低剂量队列（200 mg，每日一次）共纳入6例经病理活检确诊的不同分期肝纤维化患者（图6A-B）。经过24周治疗，5例患者的肝脏硬度值（LSM）呈进行性下降（图6C-D）。多种无创纤维化指标（S指数、GPR、RPR、FIB-4）在多数患者中呈现改善或维持稳定的趋势（图6E-H）。肝功能指标（ALT、AST、ALB）在治疗期间总体稳定，其中1例基线异常升高的患者转氨酶接近恢复正常（图6I-K）。治疗期间未见严重不良事件，仅发生6例轻微治疗相关不良事件。总的来说，在这6名接受低剂量TDI01治疗的患者中，出现了减轻肝纤维化的趋势，且安全性相对良好。

图6. TDI01可缓解6例受试患者的肝纤维化程度

治疗结束后对6例患者进行二次肝活检，病理结果显示5例患者肝组织胶原沉积显著减少（图7A-B）。H&E染色显示，5例患者的纤维化分期（METAVIR、NAFLD、Scheuer评分系统）均有明显改善，其中2例基线为肝硬化的患者亦呈现组织学改善（图7C-D）。多重免疫荧光染色证实，TDI01治疗后患者肝组织中pROCK2水平显著下降，而pROCK1水平无明显变化（图7E-F），验证了其靶向选择性。以上结果表明，本项小样本探索性研究初步提示，TDI01可安全有效地减轻肝纤维化，其对ROCK2的选择性抑制可能是其发挥抗纤维化作用的分子基础。

图7. TDI01通过抑制ROCK2活性改善纤维化

总的来说，这项研究实现了从靶点发现、药物研发到临床转化的全链条突破，为肝纤维化治疗提供了全新的靶向策略，具有重要的科学价值与临床意义。

图8. 研究模式图

关于我们
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。