海藻酸盐-明胶基材料用于生物3D打印制备骨骼肌组织工程支架的研究
2025-09-15 来源:本站 点击次数:126
本研究针对容积性肌肉损失（VML）（局部组织缺失≥20%，无法自愈的严重骨骼肌损伤）治疗需求，开发海藻酸盐 - 明胶复合生物墨水用于挤出 3D 生物打印。其中12% w/v 海藻酸盐与 6% w/v 明胶（A12-G6） 墨水表现最优，通过优化打印参数（30kPa 压力、15mm/s 速度）及交联条件（500mM CaCl₂交联 15 分钟），制备的支架刚度达45-50kPa（匹配天然骨骼肌 30-50kPa 的刚度范围）、溶胀率高达70%（利于营养渗透）、14 天降解率维持28%（降解稳定），且能支持 C2C12 肌细胞增殖（7 天增殖量显著高于 3 天，p<0.05），为 VML 等骨骼肌损伤治疗提供了兼具结构保真度与生物活性的优质支架方案。
一、研究背景与意义
1.骨骼肌损伤与 VML 定义
普通损伤：肌纤维部分坏死，但基底膜、肌鞘及邻近血管完整，人体可通过天然能力自愈。
容积性肌肉损失（VML）：局部肌肉组织缺失≥20%，由爆炸、严重坠落、道路事故或肿瘤切除引发，损伤区域破坏严重，导致肌肉丧失再生功能性新肌肉的能力，是军民领域最严重的急性骨骼肌损伤之一。
2.VML 现状与现有治疗缺陷
高发数据：美国每年约 25 万例合并 VML 的开放性骨折；战场受伤军人中 92% 的肌肉损伤为 VML，患者常面临慢性功能障碍、终身残疾。
现有治疗局限：
自体移植物：供区并发症常见，肌肉整合效果差，力学性能不佳，高质量移植物获取困难。
脱细胞支架：易引发病理性纤维化反应，导致肌肉功能形成异常；传统制造难以重现肌肉复杂结构。
3.研究目标：开发适配挤出 3D 生物打印的海藻酸盐 - 明胶复合生物墨水，优化配方与打印 / 交联参数，制备兼具结构保真度、力学匹配性与生物相容性的支架，用于 VML 治疗。
二、材料与实验方法
1.核心材料与墨水配方（表 1）
2.墨水制备流程
海藻酸钠溶解：在 1×PBS 中 80℃磁力搅拌 1 小时，至完全溶解（设 4 种浓度）。
明胶溶解：在 1×PBS 中 60℃搅拌 30 分钟，浓度固定为 6% w/v。
复合混合：明胶溶液与海藻酸钠溶液以 1:1（v/v）比例缓慢混合，60℃持续搅拌 1 小时确保均匀。
预处理：打印前将复合墨水置于加热板达 37℃，储备液 4℃保存备用。
3.支架挤出打印与参数优化
设备：BioX 生物打印机（CellInk 公司），27G 透明喷嘴，3mL 气动料筒。
参数范围：打印压力 10-30kPa、打印速度 15-30mm/s、层高度 0.1-0.2mm；填充密度 25%，打印平台温度 25℃（明胶热交联），喷嘴温度 30℃。
定性评级：采用 1-5 分制（1 最差，5 最佳），≥3.5 分的参数组合用于后续定量分析。
CELLINK BIO X
4.关键测试方法
可挤出性：手动挤出 37℃墨水，观察是否形成连续纤维（非液滴）。
流变学：Physica MCR 301 流变仪，平行板夹具（37±0.1℃），通过振幅扫描（ω=10rad/s，应变 0.1-1000%）确定线性黏弹区（LVR），频率扫描（0.1-100rad/s）分析黏弹性，剪切速率 0.01-1000s⁻¹ 测黏度。
打印精度：ImageJ 软件分析支架图像，公式P=1−b∣a−b∣×100（a = 实际打印面积，b = 设计面积）。
力学性能：万能试验机（UTM）压缩测试，圆柱形支架（φ20mm× 高 4mm），0.1mm/s 预调节 10 次（10% 应变），0.1mm/s 加载至破裂，取应力 - 应变线性区斜率为刚度。
溶胀 / 降解分析：
溶胀率：交联后称初始质量 Wi，DMEM 中 37℃浸泡 3/7/14 天，吸干称 Wf，公式S=Wf−Wi/Wi×100。
降解率：交联后冷冻干燥称初始干重 Wd，DMEM 浸泡后冷冻干燥称 Wf，公式D=Wd−Wf/Wd×100。
生物相容性：500mM CaCl₂交联 15 分钟，乙醇浸泡 + 紫外线灭菌，接种 C2C12 肌细胞，MTT 法测 570nm 处吸光度（OD570），评估 3/7 天细胞增殖情况。
统计学：3 次重复实验，单因素 / 双因素 ANOVA，Tukey 检验，p<0.05 为差异显著。
三、核心实验结果
1.可打印性与打印参数优化（表 2）
2.流变学性能
黏弹性：所有墨水均呈黏性特征（G''>G'），海藻酸盐浓度越高，储能模量（G'）、损耗模量（G''）越高；频率扫描中，G'、G'' 随角频率升高线性上升（p<0.05）。
流动行为：均表现剪切变稀特性（n<1，表 3），A12-G6 稠度指数 m 最高（1.4003Pa・s），黏度比水高 2-3 个数量级，适配挤出打印需求。
3.打印精度：A12-G6 打印精度达99.94%，显著高于 A8-G6（91%）、A6-G6（72%）、A4-G6（18%）（p<0.05），证实高海藻酸盐浓度可提升打印分辨率。
4.交联对支架力学性能的影响
刚度规律：CaCl₂浓度越高、海藻酸盐含量越高，支架刚度越高（p<0.05）；A12-G6 在 500mM CaCl₂交联 15 分钟后，刚度达45-50kPa，与天然骨骼肌（30-50kPa）刚度匹配，且整体刚度均匀（无内核柔软问题）。
结构影响：500mM CaCl₂交联的支架边缘、孔隙轮廓更清晰，结构稳定性最优。
5.溶胀与降解特性
溶胀率：A12-G6 在 500mM CaCl₂交联后溶胀率最高达70%（p<0.05），利于营养物质与氧气渗透；A4-G6/A6-G6 溶胀率仅 2%-9%，且易碎裂。
降解率：A12-G6 在 500mM CaCl₂交联后，14 天降解率维持28%（降解稳定）；A4-G6 降解快（12 天碎裂），A6-G6/A8-G6 后期（11 天后）降解加速。
6.生物相容性：所有支架均支持 C2C12 肌细胞增殖，7 天细胞增殖量显著高于 3 天（p<0.05）；高海藻酸盐浓度支架（如 A12-G6）初期（3 天）增殖较少，但 7 天均恢复正常，证实生物相容性良好。
四、研究结论
1.最优配方：12% w/v 海藻酸盐与 6% w/v 明胶（A12-G6） 是本研究最优生物墨水，可挤出性、结构保真度、打印精度均显著优于其他配方。
2.关键工艺参数：最佳交联条件为500mM CaCl₂溶液浸泡 15 分钟，最优打印参数为 30kPa 压力、15mm/s 速度。
3.性能优势：A12-G6 支架刚度 45-50kPa（匹配骨骼肌）、溶胀率 70%（营养渗透优）、降解稳定（14 天 28%）、生物相容性良好，能为 VML 治疗提供适宜的细胞微环境。
4.应用前景：该支架为 VML 等骨骼肌损伤治疗提供了新型解决方案，后续可进一步开发载细胞 “活性” 支架，提升组织再生效率。
四、关键问题与答案
问题 1：本研究确定的最优海藻酸盐 - 明胶生物墨水配方是什么？其在可打印性和支架核心性能上为何优于其他配方？
答案：最优配方为12% w/v 海藻酸盐与 6% w/v 明胶（A12-G6） ，优势体现在两方面：
可打印性：手动挤出时能形成连续纤维（非液滴），适配挤出 3D 打印；优化打印参数（30kPa 压力、15mm/s 速度）后评分达 4.5/5，显著高于 A4-G6（≤1.5 分）、A6-G6（3.0 分）、A8-G6（4.0 分）；打印精度达 99.94%，是唯一能形成贯通孔隙结构的配方（其他配方无孔隙或仅部分孔隙）。
支架性能：500mM CaCl₂交联 15 分钟后，刚度达 45-50kPa（与天然骨骼肌 30-50kPa 的刚度范围完全匹配，其他配方如 A8-G6 刚度显著更低）；溶胀率高达 70%（利于营养与氧气渗透，A4-G6 仅 2%-6%）；14 天降解率维持 28%（降解稳定，适配 VML 长期治疗，A4-G6 12 天即碎裂），且能支持 C2C12 肌细胞正常增殖（7 天增殖量显著高于 3 天，p<0.05）。
问题 2：交联剂（CaCl₂）浓度和交联时间如何影响海藻酸盐 - 明胶支架的刚度与结构稳定性？最终确定的最优交联条件基于什么依据？
答案：
影响规律：
①CaCl₂浓度：在相同交联时间（15 分钟）下，CaCl₂浓度越高，支架刚度越高（p<0.05）。例如 A12-G6 支架在 300mM、400mM、500mM CaCl₂交联后，刚度逐步升高，且 500mM 时支架边缘与孔隙轮廓更清晰（低浓度时结构易模糊）；同时，高浓度 CaCl₂能促进支架内核充分交联（低浓度如 300mM 时，A4-G6/A6-G6 仅外表面凝固，内核仍柔软）。
②交联时间：在 500mM CaCl₂浓度下，交联 15 分钟的支架刚度显著高于 5 分钟、10 分钟（p<0.05），且 15 分钟能避免支架因交联不充分导致的结构松散（如 5 分钟交联的 A12-G6 支架易变形）。
最优交联条件依据：500mM CaCl₂浸泡 15 分钟，此条件下 A12-G6 支架刚度达 45-50kPa（匹配骨骼肌力学特性），整体刚度均匀，结构轮廓清晰，且溶胀（70%）与降解（14 天 28%）性能最优，能同时满足力学匹配性与结构稳定性需求。
问题 3：与现有 VML 治疗手段（自体移植物、脱细胞支架）相比，本研究开发的 3D 打印海藻酸盐 - 明胶支架具有哪些不可替代的优势？
答案：
解决自体移植物的核心缺陷：无需从患者体内获取供体组织，彻底避免供区并发症（如感染、疼痛）；支架刚度 45-50kPa（优于自体移植物的力学性能），且可通过调整海藻酸盐浓度、交联参数适配不同损伤部位的力学需求，无需担忧高质量移植物获取困难的问题。
克服脱细胞支架的功能局限：支架由海藻酸盐（可生物降解、生物相容）与明胶（含 RGD 细胞黏附基序，促进 C2C12 细胞黏附与肌管形成）复合制成，不会引发病理性纤维化反应；3D 打印能精准构建贯通孔隙结构（A12-G6 支架孔隙清晰贯通），为细胞迁移、增殖提供通道，避免脱细胞支架 “肌肉功能形成异常” 的问题。
额外功能优势：支架溶胀率达 70%（远高于传统支架），能高效渗透营养物质与氧气，为细胞提供充足微环境；降解稳定（14 天 28%），可长期维持结构完整性（适配 VML 数月的治疗周期）；且能通过挤出打印制备 “定制化” 支架（根据 VML 缺损尺寸调整设计），后续还可集成肌细胞制备 “活性” 支架，进一步缩短组织再生时间，这些均是现有治疗手段无法实现的。
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一、研究背景与意义
普通损伤：肌纤维部分坏死，但基底膜、肌鞘及邻近血管完整，人体可通过天然能力自愈。
容积性肌肉损失（VML）：局部肌肉组织缺失≥20%，由爆炸、严重坠落、道路事故或肿瘤切除引发，损伤区域破坏严重，导致肌肉丧失再生功能性新肌肉的能力，是军民领域最严重的急性骨骼肌损伤之一。
2.VML 现状与现有治疗缺陷
高发数据：美国每年约 25 万例合并 VML 的开放性骨折；战场受伤军人中 92% 的肌肉损伤为 VML，患者常面临慢性功能障碍、终身残疾。
现有治疗局限：
自体移植物：供区并发症常见，肌肉整合效果差，力学性能不佳，高质量移植物获取困难。
脱细胞支架：易引发病理性纤维化反应，导致肌肉功能形成异常；传统制造难以重现肌肉复杂结构。
3.研究目标：开发适配挤出 3D 生物打印的海藻酸盐 - 明胶复合生物墨水，优化配方与打印 / 交联参数，制备兼具结构保真度、力学匹配性与生物相容性的支架，用于 VML 治疗。
二、材料与实验方法
1.核心材料与墨水配方（表 1）
| 海藻酸盐浓度（% w/v） | 明胶浓度（% w/v） | 试样名称 | 材料来源 / 特性 |
| 4/6/8/12 | 6（固定） | A4-G6/A6-G6/A8-G6/A12-G6 | 海藻酸钠（Sigma-Aldrich）；明胶（猪皮来源，凝胶强度 300，A 型，Sigma-Aldrich） |
| - | - | 交联剂 | CaCl₂（Sigma-Aldrich，浓度 300/400/500mM） |
2.墨水制备流程
海藻酸钠溶解：在 1×PBS 中 80℃磁力搅拌 1 小时，至完全溶解（设 4 种浓度）。
明胶溶解：在 1×PBS 中 60℃搅拌 30 分钟，浓度固定为 6% w/v。
复合混合：明胶溶液与海藻酸钠溶液以 1:1（v/v）比例缓慢混合，60℃持续搅拌 1 小时确保均匀。
预处理：打印前将复合墨水置于加热板达 37℃，储备液 4℃保存备用。
3.支架挤出打印与参数优化
设备：BioX 生物打印机（CellInk 公司），27G 透明喷嘴，3mL 气动料筒。
参数范围：打印压力 10-30kPa、打印速度 15-30mm/s、层高度 0.1-0.2mm；填充密度 25%，打印平台温度 25℃（明胶热交联），喷嘴温度 30℃。
定性评级：采用 1-5 分制（1 最差，5 最佳），≥3.5 分的参数组合用于后续定量分析。
CELLINK BIO X
4.关键测试方法
可挤出性：手动挤出 37℃墨水，观察是否形成连续纤维（非液滴）。
流变学：Physica MCR 301 流变仪，平行板夹具（37±0.1℃），通过振幅扫描（ω=10rad/s，应变 0.1-1000%）确定线性黏弹区（LVR），频率扫描（0.1-100rad/s）分析黏弹性，剪切速率 0.01-1000s⁻¹ 测黏度。
打印精度：ImageJ 软件分析支架图像，公式P=1−b∣a−b∣×100（a = 实际打印面积，b = 设计面积）。
力学性能：万能试验机（UTM）压缩测试，圆柱形支架（φ20mm× 高 4mm），0.1mm/s 预调节 10 次（10% 应变），0.1mm/s 加载至破裂，取应力 - 应变线性区斜率为刚度。
溶胀 / 降解分析：
溶胀率：交联后称初始质量 Wi，DMEM 中 37℃浸泡 3/7/14 天，吸干称 Wf，公式S=Wf−Wi/Wi×100。
降解率：交联后冷冻干燥称初始干重 Wd，DMEM 浸泡后冷冻干燥称 Wf，公式D=Wd−Wf/Wd×100。
生物相容性：500mM CaCl₂交联 15 分钟，乙醇浸泡 + 紫外线灭菌，接种 C2C12 肌细胞，MTT 法测 570nm 处吸光度（OD570），评估 3/7 天细胞增殖情况。
统计学：3 次重复实验，单因素 / 双因素 ANOVA，Tukey 检验，p<0.05 为差异显著。
三、核心实验结果
1.可打印性与打印参数优化（表 2）
| 试样名称 | 最优压力（kPa） | 最优速度（mm/s） | 最优评分 | 关键观察结果 |
| A4-G6 | -（无≥3.5 分） | - | ≤1.5 | 挤出成液滴，打印后水凝胶扩散，无孔隙 |
| A6-G6 | 10 | 15 | 3.0 | 部分孔隙，分辨率中等，无贯通结构 |
| A8-G6 | 16 | 15 | 4.0 | 大部分孔隙良好，边界清晰，但无完全贯通 |
| A12-G6 | 30 | 15 | 4.5 | 形成连续纤维，贯通孔隙清晰，结构保真度高 |
2.流变学性能
黏弹性：所有墨水均呈黏性特征（G''>G'），海藻酸盐浓度越高，储能模量（G'）、损耗模量（G''）越高；频率扫描中，G'、G'' 随角频率升高线性上升（p<0.05）。
流动行为：均表现剪切变稀特性（n<1，表 3），A12-G6 稠度指数 m 最高（1.4003Pa・s），黏度比水高 2-3 个数量级，适配挤出打印需求。
3.打印精度：A12-G6 打印精度达99.94%，显著高于 A8-G6（91%）、A6-G6（72%）、A4-G6（18%）（p<0.05），证实高海藻酸盐浓度可提升打印分辨率。
4.交联对支架力学性能的影响
刚度规律：CaCl₂浓度越高、海藻酸盐含量越高，支架刚度越高（p<0.05）；A12-G6 在 500mM CaCl₂交联 15 分钟后，刚度达45-50kPa，与天然骨骼肌（30-50kPa）刚度匹配，且整体刚度均匀（无内核柔软问题）。
结构影响：500mM CaCl₂交联的支架边缘、孔隙轮廓更清晰，结构稳定性最优。
5.溶胀与降解特性
溶胀率：A12-G6 在 500mM CaCl₂交联后溶胀率最高达70%（p<0.05），利于营养物质与氧气渗透；A4-G6/A6-G6 溶胀率仅 2%-9%，且易碎裂。
降解率：A12-G6 在 500mM CaCl₂交联后，14 天降解率维持28%（降解稳定）；A4-G6 降解快（12 天碎裂），A6-G6/A8-G6 后期（11 天后）降解加速。
6.生物相容性：所有支架均支持 C2C12 肌细胞增殖，7 天细胞增殖量显著高于 3 天（p<0.05）；高海藻酸盐浓度支架（如 A12-G6）初期（3 天）增殖较少，但 7 天均恢复正常，证实生物相容性良好。
四、研究结论
1.最优配方：12% w/v 海藻酸盐与 6% w/v 明胶（A12-G6） 是本研究最优生物墨水，可挤出性、结构保真度、打印精度均显著优于其他配方。
2.关键工艺参数：最佳交联条件为500mM CaCl₂溶液浸泡 15 分钟，最优打印参数为 30kPa 压力、15mm/s 速度。
3.性能优势：A12-G6 支架刚度 45-50kPa（匹配骨骼肌）、溶胀率 70%（营养渗透优）、降解稳定（14 天 28%）、生物相容性良好，能为 VML 治疗提供适宜的细胞微环境。
4.应用前景：该支架为 VML 等骨骼肌损伤治疗提供了新型解决方案，后续可进一步开发载细胞 “活性” 支架，提升组织再生效率。
四、关键问题与答案
问题 1：本研究确定的最优海藻酸盐 - 明胶生物墨水配方是什么？其在可打印性和支架核心性能上为何优于其他配方？
答案：最优配方为12% w/v 海藻酸盐与 6% w/v 明胶（A12-G6） ，优势体现在两方面：
可打印性：手动挤出时能形成连续纤维（非液滴），适配挤出 3D 打印；优化打印参数（30kPa 压力、15mm/s 速度）后评分达 4.5/5，显著高于 A4-G6（≤1.5 分）、A6-G6（3.0 分）、A8-G6（4.0 分）；打印精度达 99.94%，是唯一能形成贯通孔隙结构的配方（其他配方无孔隙或仅部分孔隙）。
支架性能：500mM CaCl₂交联 15 分钟后，刚度达 45-50kPa（与天然骨骼肌 30-50kPa 的刚度范围完全匹配，其他配方如 A8-G6 刚度显著更低）；溶胀率高达 70%（利于营养与氧气渗透，A4-G6 仅 2%-6%）；14 天降解率维持 28%（降解稳定，适配 VML 长期治疗，A4-G6 12 天即碎裂），且能支持 C2C12 肌细胞正常增殖（7 天增殖量显著高于 3 天，p<0.05）。
问题 2：交联剂（CaCl₂）浓度和交联时间如何影响海藻酸盐 - 明胶支架的刚度与结构稳定性？最终确定的最优交联条件基于什么依据？
答案：
影响规律：
①CaCl₂浓度：在相同交联时间（15 分钟）下，CaCl₂浓度越高，支架刚度越高（p<0.05）。例如 A12-G6 支架在 300mM、400mM、500mM CaCl₂交联后，刚度逐步升高，且 500mM 时支架边缘与孔隙轮廓更清晰（低浓度时结构易模糊）；同时，高浓度 CaCl₂能促进支架内核充分交联（低浓度如 300mM 时，A4-G6/A6-G6 仅外表面凝固，内核仍柔软）。
②交联时间：在 500mM CaCl₂浓度下，交联 15 分钟的支架刚度显著高于 5 分钟、10 分钟（p<0.05），且 15 分钟能避免支架因交联不充分导致的结构松散（如 5 分钟交联的 A12-G6 支架易变形）。
最优交联条件依据：500mM CaCl₂浸泡 15 分钟，此条件下 A12-G6 支架刚度达 45-50kPa（匹配骨骼肌力学特性），整体刚度均匀，结构轮廓清晰，且溶胀（70%）与降解（14 天 28%）性能最优，能同时满足力学匹配性与结构稳定性需求。
问题 3：与现有 VML 治疗手段（自体移植物、脱细胞支架）相比，本研究开发的 3D 打印海藻酸盐 - 明胶支架具有哪些不可替代的优势？
答案：
解决自体移植物的核心缺陷：无需从患者体内获取供体组织，彻底避免供区并发症（如感染、疼痛）；支架刚度 45-50kPa（优于自体移植物的力学性能），且可通过调整海藻酸盐浓度、交联参数适配不同损伤部位的力学需求，无需担忧高质量移植物获取困难的问题。
克服脱细胞支架的功能局限：支架由海藻酸盐（可生物降解、生物相容）与明胶（含 RGD 细胞黏附基序，促进 C2C12 细胞黏附与肌管形成）复合制成，不会引发病理性纤维化反应；3D 打印能精准构建贯通孔隙结构（A12-G6 支架孔隙清晰贯通），为细胞迁移、增殖提供通道，避免脱细胞支架 “肌肉功能形成异常” 的问题。
额外功能优势：支架溶胀率达 70%（远高于传统支架），能高效渗透营养物质与氧气，为细胞提供充足微环境；降解稳定（14 天 28%），可长期维持结构完整性（适配 VML 数月的治疗周期）；且能通过挤出打印制备 “定制化” 支架（根据 VML 缺损尺寸调整设计），后续还可集成肌细胞制备 “活性” 支架，进一步缩短组织再生时间，这些均是现有治疗手段无法实现的。
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