做骨髓组织空间转录组实验总遇坎？
脱钙担心伤 RNA、切片老脱片、数据质量上不去…… 别愁！
这份骨髓组织空转制备实验流程指南来救场，逐步骤拆解关键操作，让您的研究少走弯路！
1、骨髓组织样本如何制备？
（1）样本采集
骨髓组织 “新鲜度” 是 RNA 质量的关键，样本离体后需 30 分钟内完成固定，杜绝 RNA 降解！小鼠样本需取股骨、胫骨等部位，沿冠状面或矢状面切开以暴露骨髓；人骨髓组织样本则要重点关注组织厚度，避免影响固定液渗透效果。
（2）固定环节
推荐使用 4% 多聚甲醛进行固定，其纯度高、背景信号低，不仅能减少组织收缩，对脂肪和各类酶的固定效果也更优，尤其适配免疫荧光、荧光原位杂交等精细实验。
特别注意：固定后需用流水冲洗过夜，彻底去除残留固定液，为后续操作排除干扰。
（3）脱钙处理
骨髓组织含钙化成分，脱钙是成功切片的基础，建议选用 0.5M EDTA（pH7.5）温和脱钙，4℃条件下结合磁力搅拌或摇床处理 3-14 天，期间每 2-3 天更换一次脱钙液。
脱钙终点判断：用尖镊子或针尖轻戳组织，若能轻松扎透或组织明显变软，即可停止脱钙，避免过度处理损伤组织。
（4）脱水与包埋
脱水步骤需用梯度乙醇（50%-100%）逐步处理，其中 70% 乙醇可在 4℃下过夜；95%、100% 等高浓度乙醇则需严格把控处理时间，防止组织变脆影响后续切片。
包埋时按常规石蜡包埋流程操作，但要格外注意骨髓组织的摆放方向，确保切片时能完整暴露目标研究区域。
2、骨髓组织切片和防脱的技巧是什么？
（1）切片厚度
骨髓组织切片易脱片，建议将厚度控制在 4μm（常规 FFPE 样本多为 5μm），既能降低脱片风险，又能保障基因捕获效率，兼顾实验稳定性与数据质量。
（2）防脱片技巧
- 优先选用官方推荐的防脱载玻片，从材质上增强组织与玻片的黏附力，减少脱落隐患；
- 适当延长烤片时间，让组织与玻片贴合更紧密，提升后续操作中的稳定性；
- 脱蜡、杂交等操作需 “温柔进行”，加液时放缓速度，避免液体冲击导致组织脱落。
3、骨髓组织切片质控的标准是什么？
DV200
定义：以长度＞200 核苷酸的 RNA 片段占比来衡量，可直观反映 RNA 的完整程度。
标准：合格线为 DV200＞30%，一旦低于该数值，后续实验建议暂停或重新制备样本。
4、总结：搞定骨髓组织空间转录组实验，3 个核心要点记牢
“优先守护 RNA”：从固定到脱钙的全流程，都要把减少 RNA 损伤放在第一位，DV200 作为核心指标，必须严格把控；
脱片问题重点破：切片厚度、防脱载玻片挑选、操作时的轻柔程度，这些细节是保障数据完整的关键；
流程调整要灵活：依据样本类型（小鼠 / 人）、实验目标（常规检测 / 精细分析）适配方法，别生搬硬套模板。
