细胞传代是细胞培养中维持细胞活性和增殖的关键操作，通过将密集生长的细胞分散后接种到新的培养容器中，为细胞提供充足的生长空间和营养，避免细胞因接触抑制或营养耗尽而停止生长甚至死亡。以下是关于细胞传代的详细介绍：
 
一、细胞传代的基本原理
 
大多数贴壁生长的细胞（如上皮细胞、成纤维细胞）在生长至80%-90% 汇合度（即细胞铺满培养容器底面的比例）时，会因空间不足和营养消耗出现生长停滞，此时需通过胰蛋白酶等消化酶使细胞脱离基质，分散成单个细胞后，按一定比例接种到新的培养瓶中，实现传代。
 
悬浮生长的细胞（如某些淋巴细胞）虽无需消化，但当细胞密度过高时，也需通过稀释后转移到新容器中传代。
 
二、细胞传代的操作步骤（以贴壁细胞为例）
 
1、准备工作
 
试剂：完全培养基（含血清和抗生素）、胰蛋白酶（常用 0.25% 胰酶 - EDTA 混合液，EDTA 辅助细胞脱离）、PBS 缓冲液（无钙镁离子，避免影响胰酶活性）。
 
器材：超净工作台、培养瓶 / 皿、移液枪及枪头、离心管、酒精灯等，需提前灭菌并在超净台内紫外线消毒 30 分钟。
 
细胞状态检查：在显微镜下观察细胞汇合度，确认无污染（如无悬浮杂质、培养液清澈），生长状态良好（细胞形态完整、透亮）。
 
2、具体操作
 
弃去旧培养基：倾斜培养瓶，轻轻吸去或倒出旧培养液，避免直接冲击细胞层。
 
洗涤细胞：加入适量 PBS（如 T25 培养瓶加 2-3mL），轻轻晃动后弃去，目的是洗去残留血清（血清会抑制胰酶活性）。
 
消化细胞：加入适量胰酶（覆盖细胞层即可，如 T25 瓶加 1-2mL），37℃培养箱中静置 1-3 分钟（不同细胞消化时间不同，需在显微镜下观察：细胞变圆、间隙增大即消化完成）。
 
终止消化：加入等量或过量的完全培养基（含血清），终止胰酶作用，用移液枪轻轻吹打细胞层，使细胞分散成单细胞悬液。
 
计数与接种：取少量细胞悬液计数，按所需密度（如 1×10⁵-5×10⁵个 /mL）接种到新的培养瓶中，加入适量完全培养基，轻轻摇匀，标记细胞名称、传代日期和代数。
 
培养：将新接种的细胞放入 37℃、5% CO₂培养箱中培养，次日观察细胞贴壁和生长情况。
 
三、关键注意事项
 
1、消化时间控制
 
胰酶消化过度会损伤细胞（导致细胞膜破裂），消化不足则细胞分散不完全（成团生长，影响传代效率）。需根据细胞类型调整时间（如上皮细胞较易消化，成纤维细胞可能需更长时间）。
 
2、避免污染
 
操作全程在超净台内进行，严格无菌操作：手消毒、器材火焰灼烧（如瓶口）、避免试剂瓶口接触其他物品。
 
若发现培养液浑浊（细菌污染）、出现白色 / 黑色斑点（真菌污染），需立即丢弃细胞，避免污染扩散。
 
3、传代比例
 
根据细胞生长速度调整传代比例（如快速生长的细胞 1:5-1:10 传代，慢速生长的细胞 1:2-1:3 传代），确保传代后细胞有足够空间生长，避免密度过高或过低。
 
4、细胞代数管理
 
原代细胞和有限传代细胞有寿命限制，需记录传代次数，避免过度传代导致细胞形态改变或功能异常。无限细胞系虽可长期传代，但也需定期冻存，防止突变。
 
四、悬浮细胞传代的特殊点
 
无需胰酶消化，直接将培养瓶中的细胞悬液转移至离心管，1000-1500rpm 离心 5 分钟，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞，按适当比例接种到新培养瓶即可。
 
细胞传代是细胞培养的基础技术，熟练掌握操作细节（如消化时间、无菌控制）是保证细胞活力和实验重复性的关键。不同细胞类型的特性差异较大，建议根据具体细胞的培养手册调整操作参数。