猪ELISA试剂盒标准曲线制作流程详解
2025-10-23 来源:本站 点击次数:30
以下是猪ELISA试剂盒标准曲线制作的详细步骤及注意事项，综合了多个可信来源的实验方法和技术要点：
一、标准曲线制作流程
1、标准品准备
使用试剂盒提供的标准品，通常需按说明书进行梯度稀释（如0、0.1、1、10、100、1000 ng/mL）。
建议采用倍比稀释法确保浓度准确性，每个浓度至少设3个重复孔。
2、实验操作
将标准品加入包被抗体的酶标板孔中，孵育后依次加入检测抗体、HRP标记二抗及显色底物（如TMB）。
显色时间控制在15-20分钟，终止反应后立即测定450 nm吸光度（OD值）。
3、数据拟合
以标准品浓度为X轴，OD值为Y轴绘制散点图，常用拟合模型包括：
四参数Logistic（S型曲线首选）
直线回归（适用于线性范围）
二次曲线（中低浓度段）
选择拟合度最佳模型（R²≥0.98为佳）。
二、关键注意事项
1、标准品处理
溶解前需离心（10,000×g 1分钟），涡旋混匀避免沉淀。
避免反复冻融，分装后-20℃保存。
2、实验条件控制
孵育温度需恒定（如37±1℃），避免酶标板堆叠导致温差。
洗涤需彻底（3-5次/孔），减少背景信号。
3、异常排查
OD值偏低：检查试剂有效期、标准品溶解状态及显色时间。
无信号：验证HRP酶活性（混合底物观察显色）。
高背景：优化封闭条件（如5% BSA）或增加洗涤次数。
三、数据计算示例
使用Excel或专业软件（如Curve Expert）输入OD值，反算样本浓度。
若样本稀释N倍，最终浓度需乘以稀释倍数。
四、推荐工具
ELISA Calc：支持多种拟合模型，可扣本底及取对数处理。
Curve Expert 1.4：适用于四参数等复杂拟合。
通过以上步骤可确保标准曲线的准确性和重复性，为猪样本蛋白定量提供可靠依据。通过以通过以上步骤，可以准确地制作出猪ELISA试剂盒的标准曲线，并据此正确解读样品中的抗原浓度。
一、标准曲线制作流程
1、标准品准备
使用试剂盒提供的标准品，通常需按说明书进行梯度稀释（如0、0.1、1、10、100、1000 ng/mL）。
建议采用倍比稀释法确保浓度准确性，每个浓度至少设3个重复孔。
2、实验操作
将标准品加入包被抗体的酶标板孔中，孵育后依次加入检测抗体、HRP标记二抗及显色底物（如TMB）。
显色时间控制在15-20分钟，终止反应后立即测定450 nm吸光度（OD值）。
3、数据拟合
以标准品浓度为X轴，OD值为Y轴绘制散点图，常用拟合模型包括：
四参数Logistic（S型曲线首选）
直线回归（适用于线性范围）
二次曲线（中低浓度段）
选择拟合度最佳模型（R²≥0.98为佳）。
二、关键注意事项
1、标准品处理
溶解前需离心（10,000×g 1分钟），涡旋混匀避免沉淀。
避免反复冻融，分装后-20℃保存。
2、实验条件控制
孵育温度需恒定（如37±1℃），避免酶标板堆叠导致温差。
洗涤需彻底（3-5次/孔），减少背景信号。
3、异常排查
OD值偏低：检查试剂有效期、标准品溶解状态及显色时间。
无信号：验证HRP酶活性（混合底物观察显色）。
高背景：优化封闭条件（如5% BSA）或增加洗涤次数。
三、数据计算示例
使用Excel或专业软件（如Curve Expert）输入OD值，反算样本浓度。
若样本稀释N倍，最终浓度需乘以稀释倍数。
四、推荐工具
ELISA Calc：支持多种拟合模型，可扣本底及取对数处理。
Curve Expert 1.4：适用于四参数等复杂拟合。
通过以上步骤可确保标准曲线的准确性和重复性，为猪样本蛋白定量提供可靠依据。通过以通过以上步骤，可以准确地制作出猪ELISA试剂盒的标准曲线，并据此正确解读样品中的抗原浓度。
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