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Kilobaser DNA合成仪在 CRISPR/Cas9 基因编辑中的适用性研究

2025-10-27     来源:本站     点击次数:58


 
本文展示了如何使用Kilobaser one-XT DNA/RNA合成仪制备 CRISPR/Cas9 系统所需的 DNA 模板，进而转录生成sgRNA；实验发现，合成过程中残留的保护基团、盐等会抑制转录酶和脱氧核糖核酸酶活性，而通过OliPure HIC 纯化试剂盒去除残留物后，该 DNA 模板转录的 sgRNA 产量与功能，与寡核苷酸供应商提供的 DNA 模板完全一致；最终证明，将 Kilobaser 合成仪、标准试剂与纯化试剂盒结合，可让任何实验室自主实现 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑。

思维导图

一、核心背景与结论
  • 技术基础：CRISPR/Cas9是 RNA 引导的基因编辑工具，体外应用需通过转录 DNA 模板制备sgRNA，市售体外转录试剂盒可在30 分钟内完成 sgRNA 制备。
  • 核心问题：转录试剂盒中的转录酶和脱氧核糖核酸酶会被 DNA 合成残留物（盐、保护基团、截短寡核苷酸等）抑制。
  • 解决方案：使用Kilobaser one-XT 合成仪合成 DNA 模板，搭配OliPure HIC 纯化试剂盒去除残留物。
  • 实验结论：纯化后的 Kilobaser DNA 模板，与寡核苷酸供应商提供的模板相比，转录的 sgRNA产量和功能完全一致，证明该组合可支持实验室自主 CRISPR/Cas9 基因编辑。
二、CRISPR/Cas9 系统核心原理
（一）系统组成
CRISPR/Cas9 切割系统主要由单导向 RNA（sgRNA）和 Cas9 核酸酶构成。其中，sgRNA 是经工程改造的单一序列，由天然的 crRNA（负责引导 Cas9 定位至目标 DNA 位点，含与 DNA 靶序列互补的 20nt 靶向区域）和 tracrRNA（为 Cas9 结合提供支架，由三个茎环组成）组成。

（二）切割机制
  1. sgRNA 先与 Cas9 核酸酶结合，形成 Cas9-sgRNA 复合物，此复合物会使 Cas9 进入活性构象，随后扫描相邻双链 DNA 以寻找 3 个碱基对的 NGG 原间隔区相邻序列（PAM）。
  2. 结合 PAM 序列后，双链 DNA 解旋，sgRNA 可与其中一条 DNA 链退火；若 PAM 附近 DNA 序列与 sgRNA 的 crRNA 序列充分互补，Cas9 会切割 DNA 靶标，产生平端双链断裂。
  3. 实际负责切割的是 Cas9 的两个独立结构域：RuvC 结构域负责切割非互补 DNA 链，HNH 结构域负责切割互补 DNA 链。
​图1、CRISPRICas9系统对DNA的切割作用。SgRNA(由crRNA和tracrRNA组成)在基因组DNA上定位并激活Cas9核酸酶。Cas9的精确定位取决于cIRNA与靶DNA及PAM序列互补的DNA链结合。在PAM序列附近，两种核酸酶结构域-RuvC和HNH--分别切割两条DNA链，形成双链断裂。

三、sgRNA 体外制备关键环节
  1. 常规方案：用 NEB 的 EnGen® sgRNA 合成试剂盒，经 “寡核苷酸杂交→双链 DNA 延伸→DNA 转录” 三步，1 小时内合成 sgRNA，但需高质量 DNA 模板。
  2. 核心问题：Kilobaser 合成仪制备 DNA 模板时，会产生抑制转录酶、DNase 的残留物（盐、保护基团等），影响 sgRNA 合成与功能。
  3. 解决方案：用 OliPure HIC 纯化试剂盒去除残留物，可消除抑制作用。
四、实验设计与结果
  1. DNA 模板：设计 55nt 序列（T7 启动子 + 5'-dG+crRNA+SpCas9 支架），用 Kilobaser 合成后分 “纯化 / 未纯化” 组，以供应商模板为对照。
  2. sgRNA 合成：纯化组 sgRNA 产率（4~25μg）与供应商模板一致，未纯化组产率最低。
  3. Cas9 活性检测：纯化组制备的 sgRNA 切割质粒效率高（2.5kb 线性条带明显，未裂解质粒少）；未纯化组切割效率低；对照（仅 sgRNA / 仅 Cas9）无切割，证明 sgRNA 靶向有效。
五、结论
CRISPR/Cas9 的适用性依赖 sgRNA 的质量与可获得性，对于频繁使用该技术的研究实验室，内部合成是优质解决方案。Kilobaser one 合成器可快速、简便制备靶标特异性 DNA 寡核苷酸，作为体外转录试剂盒的 DNA 模板；但需通过 OliPure HIC 试剂盒去除合成残留物（避免干扰酶活性），纯化后的 Kilobaser DNA 寡核苷酸能为 CRISPR/Cas9 切割系统提供功能性 sgRNA，因此 Kilobaser one-XT DNA 合成仪实验室自主开展 CRISPR/Cas9 相关研究的可靠工具。
 


关键问题与答案
问题 1：合成残留物对 CRISPR/Cas9 系统的 sgRNA 制备及 Cas9 活性有哪些具体影响？如何解决这一问题？

  • 影响：
  • 抑制酶活性：残留物（盐、保护基团、截短寡核苷酸）会抑制体外转录试剂盒中的转录酶（影响 sgRNA 合成效率）和脱氧核糖核酸酶（DNase I）影响 DNA 模板降解，导致 sgRNA 浓度测定不准）；
    1. 降低 sgRNA 质量：未纯化模板转录的 sgRNA 产率最低（低于纯化模板），且 Cas9 切割时未裂解质粒比例高，切割效率显著下降。
  • 解决方案：使用OliPure HIC 纯化试剂盒对 Kilobaser 合成的 DNA 模板进行纯化，可完全去除残留物，恢复酶活性，使 sgRNA 产率和切割效率与寡核苷酸供应商模板一致。
问题 2：与依赖商业寡核苷酸供应商相比，Kilobaser one-XT 合成仪结合相关试剂盒的优势是什么？适用于哪些场景？
  • 优势：
    1. 自主性强：实验室可自主合成靶标特异性 DNA 模板，无需等待供应商交付，缩短实验周期；
    2. 成本与灵活性：可按需合成特定序列（如文档中 55nt 的 CRISPR 专用模板），避免商业定制的批量限制，降低长期使用成本；
    3. 质量可控：纯化后模板的 sgRNA 产量（4~25μg）和功能与商业模板完全一致，质量有保障。
  • 适用场景：频繁使用 CRISPR/Cas9 技术的研究实验室，需长期、灵活制备不同靶标 sgRNA 的场景。
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