可视化细胞代谢新方案：比例荧光生物传感器的自动成像与分析
2025-10-29 来源:安捷伦科技 点击次数:39
引言
在探索活细胞代谢的科研工作中，使用基因编码的荧光生物传感器帮助科学家观察细胞内的关键代谢物的实时变化，不断革新着我们对细胞内部动态的理解，为疾病机制解析开辟了新路径；此外，荧光生物传感器还展现出了高通量、高内涵药物筛选的巨大应用潜力，在药物研发过程中，帮助研究者更快地找关键靶点，加速新药的研发进程，为患者带来福音。今天和大家分享一套解决方案，该方案通过 Agilent BioTek Cytation 成像平台以高通量方式利用基因编码的生物传感器进行活细胞研究。
NAD+/NADH 荧光生物传感器
NAD+/NADH 在多个细胞区室中扮演众多角色，其中最重要的功能与线粒体能量产生相关，它们通过相互转化来调节细胞内的有氧和无氧代谢过程。NAD+ 接受电子和氢离子形成还原型 NADH，这一过程是 ATP 生成的关键步骤。目前已经开发出多种能够在活细胞水平检 NAD+/NADH 的荧光生物传感器，比如 SoNar、Peredox 和 iNap 等工具，本案例中采用的 Peredox 传感器将绿色荧光蛋白的亮度与 NADH 的相对丰度耦合在一起，因此随着 NAD+/NADH 增加，Peredox 的绿色强度也会增加；此外，Peredox 设计还包括第二个稳定的 mCherry 荧光蛋白作为参考信号，这样绿光与红光发射强度的比值使得 Peredox 报告信号独立于传感器表达水平。与强度设计相比，比率生物传感器在定量分析方面具有优势，因此，本案例中涉及的自动化策略同样适应其他比例生物传感器的使用，例如 FRET 传感器，SoNar 传感器等。
基于图像的生物传感器的高通量检测流程
由于 NAD+/NADH 比率型荧光生物传感器的设计特点通常包括两种荧光蛋白，能够提供稳定而明亮的细胞内荧光信号，非常适合于基于图像的高通量检测，一般来说，需要检测设备具有多通道、多孔位的自动化图像采集及图像分析能力，安捷伦的 Cytation&Gen5 自动化图像处理平台能够为此类比率荧光生物传感器提供优异的检测性能，主要工作流程如图 1 所示：包括生物传感器细胞内表达、细胞接种及药物处理条件优化、Cytation 自动化成像平台图像采集、Gen5 软件荧光信号单细胞分析、药物剂量响应曲线拟合和结果输出等环节。
细胞内 NAD+/NADH 的可视化检测
Peredox-mCherry-NLS 生物传感器在活体 MCF10A 细胞中可视化状态如图 2 所示。当 Peredox 传感器与 NAD+ 结合时，绿色荧光信号较暗，而当 Peredox 与 NADH 结合时，绿色荧光信号较亮。因此，荧光色通道中 Peredox 的强度表示 NAD+/NADH 比率，同时用 mCherry 的红色荧光信号做传感器总量的标准化处理。
通过在培养基中添加特定比例的超生理浓度（10 mM）乳酸和丙酮酸，能够调控细胞内 NAD+/NADH 的比例，此方法已经被验证能够有效将绿红荧光比的变化转换为胞质 NAD+/NADH 的比率。图 2 的上一行图像中，细胞处于 NAD+/NADH 低的培养基条件，而图像的下一行展示了细胞内高 NAD+/NADH 的培养基条件。
在生理条件下，胞质糖酵解速率是影响 NAD+/NADH 比率的主要因素。葡萄糖通过糖酵解生成丙酮酸、ATP 和 NADH。在 MCF10A 细胞中，Peredox 传感器的高绿/红荧光比通常指示高糖酵解活性；而低荧光比则表明糖酵解活性较低。
生物传感器作用效果的自动化图像分析流程
我们此案例使用 Agilent BioTek Cytation 5 多模式细胞成像系统和 Gen5 软件，对 Peredox 荧光生物传感器进行自动图像分析和定量，如图 3 所示。
Step1：
为了保证单细胞分析的准确度，需要使用Cytation 的 20X 以上的物镜捕获绿色和红色发射通道图像，并在 Gen5 软件中自动进行细胞识别分割（黄色轮廓）。
Step2：
计算并绘制每个孔中所有已识别的细胞核的绝对绿/红强度比值，软件可绘制图像水平的频率-柱状图。
Step3：
在多孔板矩阵视图中显示 96 孔微孔板中每个孔的绝对绿/红强度比平均值，输出孔水平的可视化色彩梯度图像。
Step4：
Gen5 软件可使用低传感器状态的孔的结果作为对照值，将绝对绿红强度比执行自动标准化操作，从而提供整个板上的标准化传感器信号比。
Step5：
软件绘制标准化的 8 点校准曲线，自动计算EC50 值（红色虚线），对应的 Kr 值约为 100。最后，Gen5 软件将使用校准曲线和实验样品孔的标准化绿红比率自动量化 NAD+/NADH 比率，以上结果与 Peredox-mCherry 已公布的响应特征非常一致。
方案优势及拓展
通过本文介绍的比例荧光生物传感器的自动成像与分析方案，能够定量细胞内的 NAD+/NADH 比率，研究者可以评估药物处理是否显著改变了细胞的代谢反应，用于建立自动化药物及筛选方案，通过 Cytation5 的单一平台，能够建立标准方案，通过方案调用检测，可实现评价流程的标准化操作，减少人为因素的干扰，极大节约人力物力成本。
除此之外，一些研究需要更定量的方法，并希望将标准化传感器比率转换为分析物水平（例如胞质 NAD+/NADH 比率），此类校准有些情况可以在活细胞中进行，对于 Peredox，可以使用已建立的方法在活细胞的整个响应范围内进行信号校准，以精确评价细胞内 NAD+/NADH 比率，Cytation5 可搭载适用于活细胞检测的气体控制系统，用于此类方案的开发。
最后，在活细胞能量的代谢领域，安捷伦还能够提供 Seahorse XF 活细胞能量代谢分析仪，通过实时监测细胞的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），能够同时分析活细胞中的糖酵解和线粒体功能。而 Cytation5 平台和 Seahorse XF 系统联合使用，可以实现从代谢活性到细胞形态、功能的全面分析。感兴趣的读者，欢迎随时和我们联系获取更多应用方案。
在探索活细胞代谢的科研工作中，使用基因编码的荧光生物传感器帮助科学家观察细胞内的关键代谢物的实时变化，不断革新着我们对细胞内部动态的理解，为疾病机制解析开辟了新路径；此外，荧光生物传感器还展现出了高通量、高内涵药物筛选的巨大应用潜力，在药物研发过程中，帮助研究者更快地找关键靶点，加速新药的研发进程，为患者带来福音。今天和大家分享一套解决方案，该方案通过 Agilent BioTek Cytation 成像平台以高通量方式利用基因编码的生物传感器进行活细胞研究。
NAD+/NADH 荧光生物传感器
NAD+/NADH 在多个细胞区室中扮演众多角色，其中最重要的功能与线粒体能量产生相关，它们通过相互转化来调节细胞内的有氧和无氧代谢过程。NAD+ 接受电子和氢离子形成还原型 NADH，这一过程是 ATP 生成的关键步骤。目前已经开发出多种能够在活细胞水平检 NAD+/NADH 的荧光生物传感器，比如 SoNar、Peredox 和 iNap 等工具，本案例中采用的 Peredox 传感器将绿色荧光蛋白的亮度与 NADH 的相对丰度耦合在一起，因此随着 NAD+/NADH 增加，Peredox 的绿色强度也会增加；此外，Peredox 设计还包括第二个稳定的 mCherry 荧光蛋白作为参考信号，这样绿光与红光发射强度的比值使得 Peredox 报告信号独立于传感器表达水平。与强度设计相比，比率生物传感器在定量分析方面具有优势，因此，本案例中涉及的自动化策略同样适应其他比例生物传感器的使用，例如 FRET 传感器，SoNar 传感器等。
基于图像的生物传感器的高通量检测流程
由于 NAD+/NADH 比率型荧光生物传感器的设计特点通常包括两种荧光蛋白，能够提供稳定而明亮的细胞内荧光信号，非常适合于基于图像的高通量检测，一般来说，需要检测设备具有多通道、多孔位的自动化图像采集及图像分析能力，安捷伦的 Cytation&Gen5 自动化图像处理平台能够为此类比率荧光生物传感器提供优异的检测性能，主要工作流程如图 1 所示：包括生物传感器细胞内表达、细胞接种及药物处理条件优化、Cytation 自动化成像平台图像采集、Gen5 软件荧光信号单细胞分析、药物剂量响应曲线拟合和结果输出等环节。
图 1：活细胞荧光生物传感器的多通道高通量图像分析工作流程
细胞内 NAD+/NADH 的可视化检测
Peredox-mCherry-NLS 生物传感器在活体 MCF10A 细胞中可视化状态如图 2 所示。当 Peredox 传感器与 NAD+ 结合时，绿色荧光信号较暗，而当 Peredox 与 NADH 结合时，绿色荧光信号较亮。因此，荧光色通道中 Peredox 的强度表示 NAD+/NADH 比率，同时用 mCherry 的红色荧光信号做传感器总量的标准化处理。
图2：生物传感器多通道成像和传感器可视化状态示意图
通过在培养基中添加特定比例的超生理浓度（10 mM）乳酸和丙酮酸，能够调控细胞内 NAD+/NADH 的比例，此方法已经被验证能够有效将绿红荧光比的变化转换为胞质 NAD+/NADH 的比率。图 2 的上一行图像中，细胞处于 NAD+/NADH 低的培养基条件，而图像的下一行展示了细胞内高 NAD+/NADH 的培养基条件。
在生理条件下，胞质糖酵解速率是影响 NAD+/NADH 比率的主要因素。葡萄糖通过糖酵解生成丙酮酸、ATP 和 NADH。在 MCF10A 细胞中，Peredox 传感器的高绿/红荧光比通常指示高糖酵解活性；而低荧光比则表明糖酵解活性较低。
生物传感器作用效果的自动化图像分析流程
我们此案例使用 Agilent BioTek Cytation 5 多模式细胞成像系统和 Gen5 软件，对 Peredox 荧光生物传感器进行自动图像分析和定量，如图 3 所示。
Step1：
为了保证单细胞分析的准确度，需要使用Cytation 的 20X 以上的物镜捕获绿色和红色发射通道图像，并在 Gen5 软件中自动进行细胞识别分割（黄色轮廓）。
Step2：
计算并绘制每个孔中所有已识别的细胞核的绝对绿/红强度比值，软件可绘制图像水平的频率-柱状图。
Step3：
在多孔板矩阵视图中显示 96 孔微孔板中每个孔的绝对绿/红强度比平均值，输出孔水平的可视化色彩梯度图像。
Step4：
Gen5 软件可使用低传感器状态的孔的结果作为对照值，将绝对绿红强度比执行自动标准化操作，从而提供整个板上的标准化传感器信号比。
Step5：
软件绘制标准化的 8 点校准曲线，自动计算EC50 值（红色虚线），对应的 Kr 值约为 100。最后，Gen5 软件将使用校准曲线和实验样品孔的标准化绿红比率自动量化 NAD+/NADH 比率，以上结果与 Peredox-mCherry 已公布的响应特征非常一致。
图 3：使用安捷伦 Cytation5 和 Gen5 图像分析软件开展生物传感器作用效果的自动化图像分析流程
方案优势及拓展
通过本文介绍的比例荧光生物传感器的自动成像与分析方案，能够定量细胞内的 NAD+/NADH 比率，研究者可以评估药物处理是否显著改变了细胞的代谢反应，用于建立自动化药物及筛选方案，通过 Cytation5 的单一平台，能够建立标准方案，通过方案调用检测，可实现评价流程的标准化操作，减少人为因素的干扰，极大节约人力物力成本。
除此之外，一些研究需要更定量的方法，并希望将标准化传感器比率转换为分析物水平（例如胞质 NAD+/NADH 比率），此类校准有些情况可以在活细胞中进行，对于 Peredox，可以使用已建立的方法在活细胞的整个响应范围内进行信号校准，以精确评价细胞内 NAD+/NADH 比率，Cytation5 可搭载适用于活细胞检测的气体控制系统，用于此类方案的开发。
最后，在活细胞能量的代谢领域，安捷伦还能够提供 Seahorse XF 活细胞能量代谢分析仪，通过实时监测细胞的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），能够同时分析活细胞中的糖酵解和线粒体功能。而 Cytation5 平台和 Seahorse XF 系统联合使用，可以实现从代谢活性到细胞形态、功能的全面分析。感兴趣的读者，欢迎随时和我们联系获取更多应用方案。
SeahorseXF 分析仪与 Cytation 多模式平台联合应用
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关于安捷伦细胞分析
安捷伦细胞分析平台包括xCELLigence RTCA实时细胞分析仪、NovoCyte系列流式细胞仪、Seahorse能量代谢分析仪以及Synergy系列微孔板检测仪和Cytation 系列（共聚焦）细胞成像多功能微孔板检测仪。安捷伦细胞分析平台聚焦基础科研与细胞与基因治疗产品的开发全流程，作为适配新一代疗法的强大分析工具，提供多方位的细胞效力检测和深度的细胞分析，并致力于研发、生产质控以及临床的全方位检测与分析方案开发。
安捷伦细胞分析平台包括xCELLigence RTCA实时细胞分析仪、NovoCyte系列流式细胞仪、Seahorse能量代谢分析仪以及Synergy系列微孔板检测仪和Cytation 系列（共聚焦）细胞成像多功能微孔板检测仪。安捷伦细胞分析平台聚焦基础科研与细胞与基因治疗产品的开发全流程，作为适配新一代疗法的强大分析工具，提供多方位的细胞效力检测和深度的细胞分析，并致力于研发、生产质控以及临床的全方位检测与分析方案开发。
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